新风胶囊通过调控巨噬细胞极化改善活动期类风湿关节炎患者炎症反应及生活质量的研究❋

曹云祥， 刘 健△， 陶艳红， 黄传兵， 黄 旦， 徐昌萍

(1.安徽中医药大学第一附属医院， 合肥 230031；2.安徽中医药大学， 合肥 230031)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是多因素导致可累及多系统的自身免疫性疾病，主要表现为对称性、侵蚀性多关节炎[1]，女性发病率较高，约为男性的3倍，多发生于30～50岁的中青年，全球患病率约1%，中国为0.32% ～0.36%[2，3]。随着疾病的发展，RA患者最终可出现关节功能障碍，对生活质量产生较大的影响。除关节表现外，该病还可累及神经、消化、血液、内分泌等多个系统，大多数患者的死亡原因为关节外病变[4，5]。目前RA的发病机制仍不明确，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1等促炎因子被认为参与RA的发生发展。目前，慢作用抗风湿药、生物制剂等一线治疗药物的临床使用极大地提高了RA治疗的成功率[6]，但治疗后会发生不同程度的不良反应，中医药治疗本病有较好的互补效应。

RA属于中医学“痹证” “尪痹”范畴，中医药辨证论治联合西药治疗RA不仅能增加疗效，减少致残率，提高生活质量，还能减少西药用量，减轻西药的毒副作用。本研究旨在通过观察中药复方新风胶囊(xinfeng capsule，XFC)对RA患者巨噬细胞极化及核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路的影响，探究其作用机制。本研究通过安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会批准(批号20190627)。

1 资料

1.1 一般资料

选择2020年5月至2020年10月安徽中医药大学第一附属医院风湿病科门诊与病房就诊病例60例RA患者，按照随机数字表法分为对照组和研究组。其中，治疗组男性6例，女性24例，平均年龄(55. 57±6.89)岁，平均病程(8.26±3.65) 年。对照组男性4例，女性26例，平均年龄(51.73±8.76)岁，平均病程(8.31±3.49) 年。2组患者年龄与病程比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 诊断标准

西医诊断标准参照2010 年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟提出的《最新RA分类标准和评分系统》，总分6分以上可诊断RA[7]。中医诊断标准参照2019年中华中医药学会发布的《RA病证结合诊疗指南》[8]。

1.3 纳入标准

符合RA分类诊断标准；年龄20～70岁；知情同意并配合药物治疗的患者。

1.4 排除标准

不符合纳入标准；合并其他系统如肿瘤、感染等疾病者；关节畸形严重者。

1.5 脱落标准

依从性差，服用药物剂量少于规定量的80%或超出120%，疗效及安全性判断受干扰者；自行退出者；病情加重或者有其他疾病需要治疗者；发生严重副作用者。

1.6 剔除标准

不遵守规定服药，随访资料欠缺者；不遵守治疗方案而影响疗效或安全性者；曾经有或者现仍滥用药物者。

1.7 主要试剂及仪器

TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10 Elisa试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司，货号JYM0110Hu、JYM0083Hu、JYM0142Hu、JYM0155Hu)；淋巴细胞分离液(加拿大StemCell公司，货号17952)；荧光定量 PCR检测试剂盒(苏州近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)；RIPA细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，货号P0013B)；核因子κB P65(nuclear factor kappa-B P65, NF-κB p65)抗体、核转录因子κB抑制蛋白α(nuclear transcription factor kappa B repressor protein alpha, IκBα)抗体(美国CST公司，货号8242 T、3033 T)；β-actin抗体、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号TA-09、ZB-2305、ZB-2301)。

2 方法

2.1 治疗方法

对照组患者给予甲氨蝶呤口服每周1次，每次4片；治疗组在对照组基础上加XFC口服治疗，每日3次，每次 3 粒。甲氨蝶呤由上海上药信谊药厂有限公司提供(国药准字H21020644，2.5 mg)。XFC组成：黄芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤，每粒含生药0.4 g，由安徽省中医院制剂中心生产(批号皖药制 Z20050062)，2 组患者均连续服药4周。

2.2 生活质量评价

RA患者生活质量采用中医证候积分量表与生活质量评价量表(short form-36, SF-36)进行评价[9，10]。由受过培训的医务人员对研究对象进行量表填写指导，所有量表在发放后1 h收回，确保全部回收并检查有无漏填之处。SF-36评分量表具体条目包括一般健康(general health, GH)、生理功能(physical functioning, PF)、生理职能(role-physical, RP)、情感职能(role-remotional, RE)、社会功能(social functioning, SF)、躯体疼痛(body pain, BP)、精力(vitality, VT)、精神健康(mental health, MH)。

2.3 Elisa检测血清炎症因子表达

取各组患者治疗前后空腹静脉血离心取上清，参考试剂盒操作说明书检测各组血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的表达。

2.4 RA相关指标RF、CCP-AB、ESR、CRP检测

取各组患者治疗前后空腹静脉血，Elisa法检测血清类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide, CCP-AB)；魏氏法检测血浆红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR),免疫透射比浊法检测血清C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)，以上指标均由安徽中医药大学第一附属医院检验中心检测。

2.5 流式细胞术检测巨噬细胞标志物CD80、CD86、CD163、CD206表达

取各组患者治疗前后空腹静脉血，免疫磁珠法分选巨噬细胞，配制含10%人AB血清和10ng/mL人GM-CSF的IMDM培养液，培养基重悬CD14细胞，诱导分化成巨噬细胞。调整巨噬细胞浓度为0.5×106/L～1×106/L个细胞，处理后上机检测。

2.6 Western blot检测巨噬细胞中NF-κB p65、IκBα蛋白表达

加入RIPA细胞裂解液，提取治疗前后各组巨噬细胞中总蛋白，加样、电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h洗涤，加一抗IκBα(1∶500)、NF-κB p65(1∶1000)4 ℃过夜，加1∶10000二抗孵育2 h，显影后拍照、保存图像并分析数据。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 脱落情况

无患者脱落，全部完成研究。

3.2 新风胶囊对RA患者生活质量的影响

表1示，与治疗前比较，2组患者治疗后中医证候积分均明显降低(P<0.01)，SF-36各条目评分均明显升高(P<0.05，P<0.01)。与对照组比较，治疗组患者SF-36量表RE、SF、BP、VT条目评分明显升高(P<0.05，P<0.01)。

表1 各组类风湿关节炎患者中医证候积分与SF-36评分比较(分，

3.3 新风胶囊对RA患者血清炎症因子的影响

表2示，与治疗前比较，2组患者治疗后TNF-α、IL-1β表达水平均明显降低，IL-4、IL-10表达水平均明显升高(P<0.01)；与对照组治疗后比较，治疗组治疗后TNF-α表达水平明显降低，IL-10表达水平明显升高(P<0.05)。

表2 各组类风湿关节炎患者血清炎症因子表达比较

3.4 新风胶囊对RA患者血RF、CCP-AB、ESR、CRP的影响

表3示，与治疗前比较，2组患者治疗后RF、CCP-AB、ESR、CRP表达水平均明显降低(P<0.01)；与对照组治疗后比较，治疗组治疗后RF、ESR、CRP表达水平明显降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 各组类风湿关节炎患者血RF、CCP-AB、ESR、CRP水平比较

3.5 新风胶囊对RA患者巨噬细胞极化标志物的影响

图1示，2组患者治疗前巨噬细胞极化标志物表达差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞术检测结果显示，2组患者治疗后与各自治疗前比较，巨噬细胞CD80、CD86 表达明显降低，CD163、CD206表达明显升高(P<0.05)；治疗组治疗后较对照组CD80、CD86 表达显著降低，CD163、CD206 表达明显升高(P<0.05)。

注：A.各组流式图； B.细胞标记率；与本组治疗前比较：*P<0.05；与对照组治疗后比较：#P<0.05；FL1-A—PE/cy7anti-humancd80，FL2-A—APC anti-humancd86，FL3-A—FITC anti-humancd206，FL4-A—PE anti-humancd163图1 各组类风湿关节炎患者治疗前后巨噬细胞极化标志物表达比较

3.6 新风胶囊对RA患者NF-κB p65、IκBα蛋白表达的影响

图2示，与治疗前比较，2组患者治疗后NF-κB p65蛋白表达明显降低，IκBα明显升高(P<0.05)；与对照组治疗后比较，治疗组患者NF-κB p65蛋白表达明显降低，IκBα明显升高(P<0.05)。

注：A.蛋白条带图；B.蛋白相对表达量；与本组治疗前比较：*P<0.05；与对照组治疗后比较：#P<0.05图2 各组类风湿关节炎患者NF-κB p65、IκBα 蛋白表达比较

3.7 不良反应

治疗过程中，观察组出现1例胃脘部不适患者，对照组出现 1 例白细胞降低患者，处理后均恢复正常。

4 讨论

RA是一种慢性、进展性和难治性的自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎、血管翳形成、软骨和骨的破坏为特征，最终可导致关节畸形[11]。RA患者关节持续疼痛、免疫炎症反应和关节功能障碍症状严重影响生活质量。甲氨蝶呤为治疗RA的一线药物，然而部分患者因多种原因不能耐受，因此寻求适合RA患者的中西医结合治疗方案有较大的临床意义。

刘健[12]认为，脾胃亏虚、气血不足、痰瘀痹阻为RA基本病机，治疗应以健脾化湿通络为法。XFC又称复方芪薏胶囊，为安徽中医药大学第一附属医院院内制剂(专利号ZL201310011369.8)，全方由黄芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤组成，应用于临床30年疗效显著。前期进行的一项大样本、多中心平行组设计、双盲的随机对照试验结果显示，XFC能够有效改善RA患者关节症状，缓解病情，总体疗效优于来氟米特[9]。XFC具有很好的抗炎、抑制免疫炎症反应的作用，能降低RA患者ESR、hs-CRP、RF、CCP等实验室指标，还能通过抑制NF-κB通路激活，降低血清中促炎因子的水平来减轻免疫炎症反应，改善RA症状[13，14]。

多种免疫细胞与炎性介质在RA发病中发挥重要作用[15]。单核巨噬细胞作为机体防御系统重要的免疫细胞，在免疫调节和炎症反应过程中具有多方面的作用。不同因素可诱导不同亚型的巨噬细胞，表现为具有促炎作用的M1型和抗炎作用M2型[16-18]。巨噬细胞大量向M1极化，炎症因子分泌失衡，诱发“细胞因子风暴”。大量的促炎因子聚集会抑制组织的修复和血管重塑，并促进免疫反应；同时M2细胞减少，抗炎因子表达下降，进一步加剧免疫炎症反应。巨噬细胞大量迁移到靶器官、组织并被激活，引起滑膜炎症及晨僵，最终导致炎性骨破坏。M1型巨噬细胞可分泌多种促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1等)，表达CD80、CD86等分子，促进炎症的发展。M2型巨噬细胞分泌抗炎因子(IL-4、IL-10、TGF-β等)，表达CD206和CD163等分子，发挥抗炎作用。因此，抑制巨噬细胞M1型炎性极化，驱动M1型转为M2型，促进恢复M1/M2型巨噬细胞动态平衡，有利于调节RA免疫炎症反应。本研究表明，XFC可能是通过降低RA患者CD80、CD86、TNF-α、IL-1β、ESR、CRP表达，升高CD163、CD206、IL-4、IL-10表达，调整M1/M2型巨噬细胞极化失衡，从而降低中医证候积分，改善生活质量。

NF-κB通路是重要的促炎传导途径，被认为是巨噬细胞极化的重要调控因子，该通路激活能促进M1/M2极化，使细胞因子表达失衡，引发炎症反应[19，20]。IκBα是NF-κB信号通路的重要成员，主要抑制NF-κB的激活及转录，调节免疫炎症反应[21]。本研究表明，XFC能显著降低NF-κB p65、升高IκBα蛋白表达，通过调控IκBα抑制NF-κB信号通路激活，继而平衡M1/M2极化，减轻RA的炎症反应，发挥治疗RA的作用。

综上，本研究初步表明，XFC能够通过抑制NF-κB通路过度活化，调控M1/M2极化，上调抗炎因子,下调促炎因子表达，改善 RA患者的生活质量。