真武汤对慢性心力衰竭大鼠心室重构的影响❋

叶嘉豪， 李 琳， 钟森杰， 杨 梦， 胡志希

(湖南中医药大学， 长沙 410208)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是指心肌收缩力下降导致心排血量降低、组织和器官血液灌注量下降，不能满足机体代谢需求，从而出现肺循环或(和)体循环障碍的临床综合征，是各种心血管疾病的终末阶段[1]。根据世界卫生组织统计，全世界CHF发病率高达2%，仅美国就有500万人患病[2]，因其具有高发病率、高死亡率等特点，已成为世界性危害公共健康问题。目前临床主要运用β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂等治疗CHF，通过抑制神经内分泌系统的过度激活改善心室重构、延缓慢性心衰发展，但总体疗效不理想，且长期服药具有一定的毒副作用[3]，因此，迫切需要寻找一种疗效好、副作用小的治疗方案。中医在治疗CHF的过程中积累了相当丰富的经验[4-7]，并能和西药联合应用，进一步提高疗效。临床常用真武汤治疗CHF，但具体作用机制尚不完全清楚[8，9]。本研究通过观察真武汤对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1、基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP)-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和Caspase-9的影响，探究真武汤对抗心室重构的作用机制，为中医药治疗CHF提供实验依据。本研究通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准(批号LL2020060401)。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠24只，6周龄，体质量200～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证号SCXK(湘)2019-0004。大鼠饲养于湖南中医药大学动物实验中心，室温(22±2)℃，湿度50%～60%，自由进食饮水，12 h光照周期。

1.2 药物及制备

茯苓(批号CX20091402)、白芍(批号TH20080602)、白术(批号NG20090401)购自湖南中医药大学第一附属医院；附子(安徽亳药干草中药饮片有限公司，批号DX200201)、生姜(当地市场，批次20191022)经湖南省中医药研究院刘杰研究员鉴定为正品。真武汤遵循原方组成，将附子、茯苓、白芍、生姜、白术按照3∶3∶3∶3∶2比例浸泡于装有无菌饮用水的陶罐中，浸泡后煎煮2次，每次30 min，药液合并后浓缩为生药含量1 g/mL，4 ℃冰箱保存[10]。阿霉素(美国APExBIO公司，货号A39662337769)；酒石酸美托洛尔片(国药准字H32025391，货号0902066，25 mg/片)，阿斯利康药业中国有限公司。

1.3 试剂与仪器

Caspase-3、Caspase-9 Elisa检测试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E08857r、CSB-E08863r)；Caspase-3、Caspase-9、TIMP-1抗体(英国Abcam公司，货号ab13847、ab52298、ab61224)；MMP-1、GAPDH抗体(美国Proteintech公司，货号10371-1-AP、10494-1-AP)。

SonoScape-S2N 型彩超仪，深圳开立科技公司；H1650R型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PW-812型全自动酶标洗板机、MB-530型多功能酶标分析仪，深圳市汇松科技发展有限公司；DHP-500型电热恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪、DYCZ-24DN型电泳槽、DYCZ-40 D型转膜仪，北京六一生物科技有限公司。

1.4 动物分组、造模与给药

适应性饲养1周后，按照随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、美托洛尔组、真武汤组，每组6只。正常组大鼠每周腹腔注射0.9%氯化钠溶液，其余大鼠每周腹腔注射阿霉素1次，质量浓度为2 mg/mL，给药剂量为0.15 mL/100 g体质量[11]。7周后，以FS<30%为慢性心衰造模成功的标准[12]。造模成功后，美托洛尔组(2 mg/mL，10 mg/kg)和真武汤组(1 g/mL，18 g/kg)连续28 d灌胃相应药物，正常组和模型组灌胃等量0.9%氯化钠溶液。

1.5 超声心动图检测

28 d给药结束后，用彩超仪于大鼠左心室长轴切面进行检测，测量左心室射血分数(ejection fraction,EF)及左心室短轴缩短率(fractional shortening,FS),每组数据测量3次取平均值。

1.6 取材

各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射进行深度麻醉(0.35 mL/100 g)，剖开胸腔切取全心，取左心室-80 ℃保存。

1.7 Elisa法检测心肌组织Caspase-3、Caspase-9含量

采用Elisa法检测各组大鼠心肌组织Caspase-3、Caspase-9含量，严格按照试剂盒说明书步骤操作。

1.8 Western blot法检测心肌组织Caspase-3、Caspase-9、MMP-1、TIMP-1蛋白表达

剪取适量左心室心尖组织，BCA法检测蛋白定量，SDS-PAGE电泳、转膜、封闭, 以Caspase-3(1∶500)、Caspase-9(1∶1000)、GAPDH(1∶3000)、MMP-1(1∶1000)、TIMP-1(1∶1000)孵育一抗，加入HRP标记的二抗(1∶6000)，ECL显色、曝光，扫描底片并用Quantity one软件对灰度值进行分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 超声心动图结果比较

表1示，模型组大鼠FS值<30%，说明CHF造模成功。与空白组比较，模型组大鼠EF、FS值显著降低(P<0.01)。与模型组比较，真武汤组与美托洛尔组大鼠EF、FS值显著上升(P<0.01)，说明真武汤与美托洛尔均能改善大鼠的心功能。

2.2 Elisa法检测各组大鼠心肌Capsase-3、Caspase-9含量比较

表2示，与空白组比较，模型组大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9含量均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，真武汤组与美托洛尔组大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9含量均显著降低(P<0.05，P<0.01)；与美托洛尔组比较，真武汤组大鼠的Caspase-3含量显著降低(P<0.01)。

2.3 各组大鼠心肌组织Caspase-3、Caspase-9、MMP-1、TIMP-1蛋白水平比较

表3图1示，与空白组比较，模型组大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9、MMP-1蛋白表达显著升高(P<0.01)，TIMP-1蛋白表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，真武汤组和美托洛尔组大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9和MMP-1蛋白表达均显著降低(P<0.05，P<0.01)，TIMP-1蛋白表达显著升高(P<0.01)。与美托洛尔组比较，真武汤组大鼠Caspase-3、Caspase-9蛋白表达降低(P<0.05),TIMP-1蛋白表达升高(P<0.05)。

注：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1，基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP)-1图1 各组大鼠心肌Caspase-3、Caspase-9、MMP-1、TIMP-1免疫印迹图

3 讨论

CHF属于中医学“心悸”“水肿”“喘证”等范畴[13]，病位在心，与肺、脾、肾相关,属于本虚标实之证。患者由于心肾阳气亏虚，水液运化失常，导致瘀血、痰饮内停，而瘀血、痰饮等病理产物又能损耗心肾阳气，故治疗时应以“温补阳气，活血利水”为主[14，15]。真武汤源于《伤寒论》，是温阳利水的代表方剂，主治阳虚水泛证。方中附子温肾壮阳，化气利水为君；白术健脾燥湿，使水有所制；茯苓淡渗利渗，使水湿从小便而去，并助白术健脾，二者共为臣药；生姜温中散寒，既助附子温阳散寒又合茯苓、白术宣散水湿；芍药一则利小便行水，二则柔肝缓急止痛，三则敛阴舒筋防止筋肉瞤动,四则防止温燥药物耗伤阴津[16]，与生姜共为佐药。现代药理研究表明，真武汤能通过兴奋下丘脑-垂体-肾上腺、下丘脑-垂体-甲状腺、降低一氧化氮与内皮素含量,延缓心衰进程，并通过调节渗透压与水通道蛋白，起到调节水液平衡的作用[17-19]。

阿霉素是一种从真菌菌株中提取的广谱高效的蒽醌类抗肿瘤药物，具有抑制DNA和RNA合成、杀灭各生长周期肿瘤细胞的作用。阿霉素与心肌有较强的亲和性，具有一定的心脏毒性，其毒性机制包括自由基产生、线粒体损伤、心肌坏死、凋亡等，从而引起心室重构最终导致CHF[20-22]。目前常利用阿霉素制备CHF的大鼠模型，具有廉价、简单、实用等优点。

心室重构是CHF发生发展的基本病理环节，目前影响心室重构的因素有心肌细胞外基质(extracellular matrix， ECM)改变、细胞凋亡过程等[23]，ECM的功能主要是维持心肌细胞的排列和协调心肌收缩性，ECM的合成和降解失衡是导致心室重构的主要因素之一[24]，而MMPs主要负责ECM的降解或重构过程。其中MMP-1为MMPs家族中的核心因子，正常情况下MMP-1表达水平极低，机体发生炎症反应、肿瘤侵袭扩散等因素刺激情况下，MMP-1表达水平则显著增加，进而增加对胶原基质的降解，导致心肌重构[25]。 而心肌TIMPs家族能抑制MMPs活性，以1∶1的比例与MMPs形成复合体，进而阻断MMPs进入胶原基质，抑制心室重构的发生发展，其中TIMP-1与MMP-1具有高度亲和性，二者之间的平衡在慢性心衰心室重构发生发展中起重要作用[26]。细胞凋亡发病机制主要包括死亡受体通路、线粒体通路等，线粒体通路主要与Caspase-9和Caspase-3相关。当机体发生氧化应激、细胞因子刺激等情况时，形成的凋亡复合体会激活 Caspase-9，使其具有酶切活性，然后继续活化下游的Caspase-3，引起级联反应，导致细胞凋亡[27，28]，其中Caspase-3是凋亡级联反应最关键的凋亡蛋白酶，它的活化说明细胞凋亡进程已发展至不可逆的阶段[29-31]。

本实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠的心肌Caspase-3、 Caspase-9、MMP-1水平显著升高，而TIMP-1的蛋白表达显著降低，表明阿霉素能够通过引起心肌细胞凋亡、提高MMP-1表达以及降低TIMP-1表达促进心室重构。真武汤能有效抑制细胞凋亡，调控MMP-1、TIMP-1含量，改善心肌重构，延缓心衰进程，且改善心肌重构程度明显优于美托洛尔。

超声心动图作为目前检测心功能、结构改变的方法之一，临床常用于检测心衰严重程度，其中EF及FS为心功能常见指标[32]。本实验结果显示，真武汤组大鼠的EF、FS值显著提高，说明真武汤具有增强心肌收缩力、提高射血分数进而改善心功能的作用。

本研究通过观察真武汤对阿霉素构建CHF大鼠心室重构的影响，证实真武汤能有效抑制心肌细胞凋亡，调控MMP-1和TIMP-1的含量，增强心肌收缩力和射血分数，进而改善心功能，延缓心衰发展的进程。本研究可为临床应用真武汤治疗CHF提供实验支持。