电针“太冲”对自发性高血压大鼠海马MDA、SOD、GSH-Px含量的影响❋

薛艳君， 吴娇娟， 张旭东， 蔚鹏程， 吴小丽， 刘清国

(北京中医药大学针灸推拿学院， 北京 100029)

高血压是指以体循环动脉血压(收缩压和/或舒张压)增高为主要特征(收缩压≥140 mmHg，舒张压≥90 mmHg)，可伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征，其发病率和致死率呈逐年上升趋势，而知晓率、治疗率和控制率相对较低[1-3]。临床常以口服降压药作为控制血压的主要方式，但长期服药会出现心率失常、头晕、面部潮红等多种不良反应[4-6]，不如针刺疗法安全有效。研究显示，针刺太冲穴降压效果明显，且能够有效改善高血压带来的心脑血管损伤[7-9]。在高血压状态下，中枢神经系统存在明显的氧化与抗氧化失衡现象[10]。中枢氧化应激与高血压疾病关系密切，但其机制相关研究却甚少。相关文献表明[11]，高血压可以导致海马的氧化应激水平增强。丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)是衡量机体氧化应激程度的重要标志物[12]。因此，本研究以自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)为模型，以电针双侧“太冲”为干预方式，通过观察SHR大鼠海马组织形态以及海马中MDA、SOD、GSH-Px的含量变化，探讨电针“太冲”对高血压海马氧化应激水平的影响。本研究通过北京中医药大学实验动物伦理委员会批准(批号BUCM-4-2018061501-2058)。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF级Wistar-Kyoto(WKY)大鼠6只，SPF级SHR大鼠12只，9周龄雄性，体质量(220±15) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK (京) 2006-0006。饲养于北京中医药大学实验动物中心 SPF 级动物实验室，自由取食及饮水。

1.2 主要试剂与仪器

水合氯醛(天津大茂化学试剂厂，302-17-0)；PBS缓冲液(广州济恒医药科技有限公司，SH3026.01)；MDA(A003-1)、SOD(A001-3)、GSH-Px(A005-50)ELISA试剂盒，南京建成生物工程研究所。

HANS-200E韩氏穴位神经刺激仪，南京济生医疗科技有限公司；BX53自动化智能型正置研究级显微镜，日本奥林巴斯公司；Leica超薄切片机(RM2235)、全自动脱水机(ASP200 S)、烤片台(HI1220)，德国徕卡公司；DH4000A电热恒温培养箱，天津泰斯特仪器有限公司；20PR -52D高速冷冻离心机，日本日立公司。

1.3 干预方法

“太冲”穴取穴方法参照《实验针灸学》(林文柱、王佩编)[13]，于后肢足背1，2跖骨凹陷处取“太冲”穴。电针组右手为刺手，直刺双侧“太冲”穴1～2 mm，连接韩式电针仪两极，连续等幅波，电流强度1 mA，频率2 Hz，留针20 min，治疗14 d，每日1次。针刺时间集中在每天下午2∶00～4∶00;模型组和空白组每日在相同时间与针刺组进行相同的捉抓固定刺激。

1.4 动物分组及取材

动物适应性饲养1周后，将12只SHR大鼠按照完全随机数字表法等分为电针组和模型组各组6只，6只WKY大鼠作为空白组。禁食12 h后大鼠称重，用10%水合氯醛(300 mg/kg)注射腹腔进行麻醉，麻醉成功后将大鼠固定于手术台，迅速断头、剪开头皮，用止血钳沿大鼠头颅中央骨缝撬开，取出脑组织放入冰生理盐水中清洗，去除其中的血液后迅速剥离出海马组织，取部分海马组织于4% 多聚甲醛溶液中固定24 h，置于4 ℃冰箱保存，用于常规苏木精伊红(HE)染色；剩余海马组织装于标记好的EP管，迅速投入液氮中，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.5 HE染色观察海马组织形态学变化

将海马组织于甲醛溶液中取出，蒸馏水冲洗干净，予以酒精浸泡脱水，二甲苯透明1 h，浸蜡常规包埋，用切片机将蜡块切成4 μm薄片，60 ℃烘烤12 h，将切片依次置于二甲苯中20 min、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、85%乙醇5 min 75%乙醇5 min，于蒸馏水中浸洗，用苏木素染细胞核8 min，蒸馏水洗后用0.6%氨水返蓝，再用伊红染细胞质4 min，酒精脱水后用二甲苯透明树胶封片，最后将切片置于光镜下(×400)观察，细胞核为蓝色，细胞质为红色。

1.6 Elisa法检测海马区MDA、SOD、GSH-Px含量

将海马组织和生理盐水按1∶9比例制备10%的脑组织匀浆，后取匀浆于离心机离心20 min(3000 r/min，离心半径13.5 cm)，取上层清液配制成适当的浓度，严格按照MDA、SOD、GSH-Px试剂盒说明书步骤操作，测定其在海马组织中的活性。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠海马齿状回区HE染色结果

图1示，采用光镜下(×400)观察各组大鼠海马齿状回区组织形态变化，结果显示空白组细胞呈圆形或椭圆形，结构完整，排列整齐，染色均一，多数细胞核深染，核仁清晰；与空白组比较，模型组染色明显变浅，出现细胞溶解碎裂、核固缩、空泡样变性等。与模型组比较，电针组细胞染色加深，核仁较清晰，细胞结构基本正常。

图1 各组大鼠海马齿状回区HE染色(×400)

2.2 各组大鼠海马中MDA、GSH含量检测结果

表1示，与空白组比较，模型组的MDA含量显著提升(P<0.01)，SOD、GSH-Px含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较，电针组MDA含量明显下降(P<0.05)，SOD含量明显上升(P<0.05)，GSH-Px含量显著上升(P<0.01)。

表1 各组大鼠大脑海马组织MDA、SOD、GSH-Px含量比较

3 讨论

SHR与人类原发性高血压的形成机制相似，是目前公认的最接近人类原发性高血压的动物模型，广泛应用于人类高血压病发病机制及高血压药物的筛选[14]。SHR大鼠易激惹、易紧张，眼球突出明显，毛色发黄无光泽，小便偏黄、大便偏干等，具有典型的中医辨证分型肝火上炎证表现[15]。太冲穴最早见于《灵枢·本输》：“太冲，行间上二寸陷者之中也”，为足厥阴肝经之原穴，是脏腑精气的留止部位。同时太冲穴又是四关穴之一，是气血阴阳离合出入的要道。因此太冲穴具有平肝潜阳、疏肝解郁、养血柔肝的功效，是治疗高血压的首选穴之一[16-20]。因此，本实验以SHR大鼠为实验模型，选取太冲穴作为治疗穴。

氧化应激参与高血压海马组织损伤[21]，受高血压影响，脑部的活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量明显增加，这些活性氧与脑部的脂肪酸结合，导致氧化应激水平增强。相关研究发现[22，23]，高血压可以引发小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，严重损伤海马神经，引起脑部微循环结构和功能严重损伤，导致认知障碍。有学者通过动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast enhancement magnetic resonance imaging, DCE-MRI)及免疫组化技术发现，高血压状态下海马区血脑屏障通透性、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G, IgG)、β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein, Aβ)等物质发生异常改变[24]。

MDA是氧自由基作用于生物膜中的不饱和脂肪酸，是发生脂质过氧化的产物，常用的氧化应激和脂质过氧化的重要生理指标[25]，可以引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，具有细胞毒性，能加剧细胞膜的损伤，通过检测MDA可以了解机体的氧化水平。SOD和GSH-Px均为抗氧化物酶，能抵抗氧化损伤。SOD是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，能够清除生物氧化过程中的超氧阴离子自由基，被认为是抗氧化系统的第一道防线[26]。GSH-Px是机体内广泛存在的一种过氧化物分解酶，具有特异性催化还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)对过氧化氢的反应，防止自由基对细胞膜的损害，是机体抗氧化能力指标之一。研究发现[27-30]，MDA含量的增加，SOD与GSH-Px含量的降低均与高血压患病风险相关。且针刺可以通过降低SHR大鼠体内MDA含量，提升SOD、GSH-Px含量，提高机体抗氧化能力，最终实现降压目的[31-33]。本实验结果显示，电针作用于SHR大鼠双侧“太冲”，可以显著降低MDA的表达水平，提升SOD、GSH-Px的表达水平，提示电针“太冲”可通过调节MDA、SOD、GSH-Px的表达水平。

综上，海马中MDA含量的增加，SOD、GSH-Px含量的减少可能是高血压发病的中枢机制之一。电针“太冲”可以通过下调MDA、上调SOD和GSH-Px来改善海马的氧化应激水平，保护海马组织，这可能是电针降压的中枢机制之一。本实验着重于氧化应激对高血压海马损伤的相关机制尚有不足，关于针刺降压的中枢氧化应激机制仍需进一步研究。