SFRP1及Dickkopf相关蛋白1在慢性牙周炎患者牙龈组织中的表达及意义

陈欣，尼加提·吐尔逊，热依拉·库尔班

(新疆医科大学第二附属医院口腔科，新疆 830001)

近年来，随着人们生活品质的不断提高，对口腔卫生问题重视程度逐渐加强，与之相关的慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)也逐渐成为了研究领域中的热点话题。CP是由菌斑、细菌引起牙周组织的一种慢性炎症性疾病[1]，常发生在牙周膜、牙龈、牙槽骨、牙骨质，其中牙槽骨的吸收是其较严重的病变，最终可导致牙齿的松动及脱落，对患者的生活质量造成严重影响[2]。有研究[3]表明，Wnt信号通路在成骨细胞的定向、分化、发育、增殖等生理过程中具有关键作用，是骨代谢调控的重要途径，也是一种检测骨丧失的生物标志物。Wnt信号因子在牙周组织中的表达异常与慢性牙周炎的进展程度相关[4]。分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein 1，SFRP1)是Wnt信号通路的重要拮抗剂，可竞争结合Wnt蛋白从而抑制Wnt通路激活[5]，能够减少炎症细胞及破骨细胞数量，降低牙周支持骨组织的破坏。另一组分泌型糖蛋白(Dickkopf1，DKK1)作为Wnt信号通路有力的抑制剂，抑制了牙周膜成纤维细胞中由Wnt介导的成骨活动，对分化起到抑制作用，同时促进骨的破坏[6-7]。本研究通过检测SFRP1和DKK1在CP患者和正常者牙龈组织中的表达水平情况，研究Wnt信号通路经典拮抗分子SFRP1和DKK1与CP的相关性，探讨SFRP1和DKK1两种蛋白在成人慢性牙周炎中发生及发展过程中的作用关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2020年1月至2020年12月就诊于新疆医科大学第二附属医院口腔医学中心的患者，其中被诊断为中、重度CP患者30例(男性18例、女性12例)为实验组，年龄35～60岁，平均(46.37±5.31)岁；病程1～6年，平均(2.62±0.70)年。牙周健康者15名(男性8名，女性7名)为对照组，年龄33～61岁，平均(46.58±5.22)岁。两组性别占比和年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：全身健康状况良好，无系统性疾病；无吸烟史或长期酗酒史；近3个月未服用抗生素、非甾体类抗炎药物及其他免疫抑制剂等药物；无累及牙龈的黏膜疾病；诊断为慢性牙周炎患者，全口余留牙≥18颗，且近半年内未接受过牙周系统治疗者；女性未处于妊娠或哺乳期；无正畸治疗史。本研究经本院医学伦理委员会研究批准(批准号：L2021013)，患者及家属均签署研究知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器

重组Anti-SFRP1抗体、重组Anti-DKK1抗体(Abcam公司，美国)，免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，山羊抗兔、鼠IgG H&L (HRP)(Abcam公司，美国)，显微镜(Nikon生物显微镜)，化学发光成像仪系统(上海勤翔科学仪器有限公司)等。

1.3 实验标本采集

选取实验组患者牙周手术中切取的口腔内牙周炎病灶部位的牙龈组织(排除根尖周组织疾病)；对照组取自拔除智齿或正畸牙过程中切取的健康牙龈组织。组织标本离体后冲洗干净，滤纸吸干。

1.4 实验方法

1.4.1 牙龈组织的苏木精-伊红染色(HE染色) 将标本用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，将包埋好的组织蜡片切片，常规进行HE染色，用ChemiScope mini化学发光仪检测、拍照，观察CP组牙龈组织的病理学改变，以及正常组的牙龈形态和组织结构，明确慢性牙周炎诊断。

1.4.2 牙龈组织的免疫组化检测(SP法) 将包埋好的牙龈组织蜡块连续切片，切片厚度4 μm，脱蜡复水，浸入乙二胺四乙酸抗原修复，放入湿盒中滴加过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶，分别加入SFEP1及DKK1工作液孵育。配置DAB显影液避光反应，复染，脱水封片，通过显微镜观察组织阳性染色程度。用苏木素复染胞核，镜下观察。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，以明确表达SFRP1及DKK1的卵巢组织作为阳性对照。

1.4.3 免疫组化结果判定 SFRP1、DKK1在牙龈组织中的表达使用着色强度积分进行双评分法判定[8]，在光镜下每张切片随机选择5个视野(400×)，观察阳性染色的细胞百分比及着色程度。以有棕黄色颗粒状沉淀为阳性细胞，着色范围以阳性染色百分比<1%为0分，2%～20%为1分，21%～50%为2分，≥50为3分；着色程度依据深浅记分，阴性着色为0分，浅黄色为1分，浅褐色为2分，深褐色为3分。上述两者相加作为着色强度的积分值。

1.4.4 牙龈组织蛋白印迹法(WB)检测 将收集到的实验组和健康组的牙龈组织，置于EP管中，放入液氮内速冻，再转移至-80 ℃冰箱中保存。样本称重研磨之后，加入10倍RIPA裂解液离心15 min，收集上清液检测蛋白浓度，剩余加入5倍缓冲液加热使蛋白变性，和配制的BCA工作液加入孔板中，酶标仪562 nm处检测其吸光度，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度，将蛋白样品浓度与标准蛋白曲线对应计算。蛋白分离置PVDF膜，将三种目的蛋白进行切割，分别孵育三种抗体，包括SFRP1、DKK1以及内参抗体β-actin。用TBST漂洗一抗孵育后的PVDF膜和HRP标记的山羊抗兔血清(二抗)，运用增强化学发光法显影，用ChemiScope mini化学发光仪检测、拍照。采用Image J软件检测目的条(SFRP1、DKK1)及内参条(actin)的灰度值，两者比值即为蛋白表达的相对信号强度。比较各组间SFRP1及DKK1相对信号强度的差异。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 牙龈组织HE染色

镜下观察，健康组：镜下见复层鳞状上皮，皮下固有层纤维结缔组织内少量慢性炎细胞浸润，未见明显异常；CP组：镜下见复层鳞状上皮，部分变薄，表面糜烂、溃疡形成，部分棘层肥厚，钉突增生，部分网状增生，皮下固有层纤维结缔组织内大量慢性炎细胞(淋巴细胞、浆细胞)浸润伴纤维肉芽组织增生，局灶可见较多中性粒细胞浸润。见图1。

2.2 免疫组织化学试验测定各组SFRP1与DKK1的定位与阳性表达情况

镜下观察，健康组牙龈组织鳞状上皮SFRP1和DKK1蛋白少见浅黄色颗粒状，表达弱，阳性表达少；中度CP组和重度CP组牙龈组织均见浅黄色颗粒状。分析发现，DKK1和SFRP1着色强度积分中度CP组中高于健康组，重度CP组高于轻度CP组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图2、图3。

表1 各组牙龈组织中SFRP1和DKK1着色强度积分比较M(P25，P75)

2.3 牙龈组织WB实验

健康组中的SFRP1及DKK1在牙龈组织中的表达水平均比CP组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。表2。

表2 SFRP1和DKK1在牙龈组织中的表达水平分析

3 讨论

有研究[9]发现Wnt信号通路与骨的发育和代谢密切相关，诱导间质干细胞向成骨分化，促进或抑制成骨细胞和破骨细胞的增殖与分化。同时有研究[10]在不同的微环境下Wnt信号通路调控牙周膜干细胞上的成骨分化，炎症因子的表达增高，加重牙周组织的破坏。

SFRP1、DKK1通过竞争结合抑制Wnt通路，成为Wnt经典信号通路重要的抑制剂，可以阻止 Wnt蛋白的下行转导，阻碍成骨细胞的活动，抑制骨的形成[11]，广泛应用于研究。有研究[12]指出牙周炎患者血清中SFRP1高表达状态时与牙周破坏程度呈正相关，并随着破坏程度的加重而逐渐升高。本研究结果显示，轻度CP组的SFRP1阳性积分值、蛋白表达水平均高于正常组，重度CP组高于轻度CP组。证明此蛋白作为分泌型蛋白可能通过在血液中的扩散等途径影响牙周炎的发展。在Li等[13]研究中，SFRP1蛋白在牙周中与成骨细胞和成纤维细胞凋谢有关，此蛋白的高表达可能促使与牙周成骨细胞表达相关基因沉默，从而引起成骨细胞的凋亡，造成牙周炎中牙槽骨的缺损流失。

研究[14]发现DKK1在牙周膜干细胞中的表达降低，可激活Wnt信号通路，引发牙周膜上的成骨干细胞分化不全，骨质降低。其他研究[15]发现CP组龈沟液中DKK1浓度高于对照组，且随着牙周的发展，DKK1的分泌亦增加，提示DKK1与慢性牙周炎的发生发展相关。本研究结果显示，轻度CP组的DKK1阳性积分值、蛋白表达水平高于正常组，重度CP组高于轻度CP组。查阅资料可知DKK1可以作为Wnt通路的抑制剂，能有效抑制骨形成，促进破骨细胞作用导致骨的破坏。DKK1蛋白在骨的代谢中扮演非常重要的作用。这也提示此蛋白在牙周炎发展过程中，面临牙槽骨缺损流失的可能作用机制是与它可以抑制Wnt通路有关。其他实验[16]在健康对照组龈沟液中亦检测到少量的DKK1蛋白，说明DKK1也参与牙龈正常生理状态的维持。

综上所述，本研究通过免疫组织化学试验检测慢性牙周炎患者牙龈组织中SFRP1和DKK1的表达，结果表明两者蛋白表达均高于健康对照组，且重度CP组高于中度CP组。SFRP1和DKK1蛋白表达与抑制Wnt通路有关，体内SFRP1和DKK1蛋白高表达可能会引起牙周炎的牙槽骨损害。