HBVpgRNA对慢性乙肝患者停药后病毒学复发的预测价值研究

莫金英 余 希 周 静 肖蒲军 瞿志军

深圳市龙岗中心医院感染科，广东深圳 518116

据统计，全球大约有2.4亿人感染乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）。在我国，HBV的感染者超过9000万例。目前，主要通过核苷（酸）类药物[nucleos （t）ide analogues，NAs]抑制乙肝病毒脱氧核糖核酸（hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV DNA）的复制，延缓肝硬化、肝癌的发生。长期的抗病毒治疗不仅会带来乳酸酸中毒、肾功能损害、肌炎等药物相关毒副作用，还会增加患者的经济及心理负担，部分患者因无法忍受长期服药而自行停药，从而导致肝炎再活动甚至肝衰竭、肝硬化的发生。因此，寻找有效的生物学标志物评估患者停药的安全性仍是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）治疗中急需解决的问题之一。共价闭合环状脱氧核糖核酸（covalently closed circular deoxyribonucleic acid，cccDNA）是导致CHB患者停药后复发的重要原因。相关研究表明，乙肝病毒前基因组核糖核酸（hepatitis B virus prege nomic ribonucleic acid，HBVpgRNA）是HBV复制的中间产物，由cccDNA转录而来，与肝细胞内的cccDNA转录活性密切相关。本研究主要比较CHB患者停用NAs治疗后病毒学复发组与未复发组患者血清中HBVpgRNA、乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）等相关指标的差异性，探讨HBVpgRNA表达水平对CHB患者停药后出现病毒学复发的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2020年1月深圳市龙岗中心医院肝病门诊就诊的42例CHB停药患者作为研究对象，对入组患者进行24个月的随访，将病毒学复发作为随访终点，根据随访结果分为病毒学复发组（20例）和未复发组（22例）。病毒学复发组中，男16例，女4例；年龄30～50岁，平均（39.50±5.99）岁。未复发组中，男18例，女4例；年龄28～53岁，平均（42.27± 7.09）岁。两组患者的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。停药时病毒学复发组有7例患者的HBVpgRNA检测阳性，未复发组有2例HBVpgRNA检测阳性。两组间的HBVpgRNA检出率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。纳入标准：①CHB患者停药前接受NAs治疗4年；②停药时乙肝病毒e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）阴性，且HBV DNA＜20 U/ml，肝功能丙氨酸转氨酶（ala nine aminotransferase，ALT）、门冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）均在正常值范围内。排除标准：①合并其他病毒如丙型肝炎病毒、艾滋病病毒感染者；②合并自身免疫性肝病或其他结缔组织病需长期使用激素或免疫抑制剂治疗者；③合并肝癌或肝硬化患者；④合并妊娠的患者。患者及其家属均知情同意本研究，且本研究经深圳市龙岗中心医院医学伦理委员会审批[批准文号：20210426022（SZLG）250001]。

1.2 方法

分别于患者停药时、停药后前3个月每个月及随后的每3个月各采集外周血15～20 ml，室温下用3500 r/min（离心机半径13.5 cm）的速度离心处理10 min分离出血清。使用美国ABI Prism 7500荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪，采用磁珠法进行HBVpgRNA检测，试剂盒购自北京热景生物技术股份有限公司；使用美国VIIA7荧光定量PCR仪，采用荧光定量PCR技术进行HBV DNA检测，试剂盒购自湖南圣湘生物科技股份有限公司；使用美国雅培I2000SR免疫分析仪，采用化学发光法进行乙肝五项定量测定，试剂盒购自美国雅培公司；使用罗氏全自动生化分析仪（C702-2），采用酶法检测肝功能，试剂盒购自罗氏集团有限公司，均严格按说明书操作。

1.3 观察指标及评价标准

病毒学复发定义为HBV DNA＞2000 U/ml，随访终点为病毒学复发，无病毒学复发患者最长随访24个月。比较病毒学复发组与未复发组患者停药时及随访结束时的HBVpgRNA、HBsAg滴度水平，并分析与病毒学复发相关的危险因素。HBVpgRNA≥300 copies/ml为阳性，将未检测到HBVpgRNA的样本赋值为150 copies/ml进行数据分析。HBsAg正常范围为0.00～0.05 U/ml，HBV DNA检测下限值为20 U/ml，ALT正常范围为7～40 U/L，AST正常范围为13～35 U/L。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组间相关指标的比较

病毒学复发组在停药时及随访结束时血清中的HBVpgRNA和HBsAg滴度水平均明显高于未复发组，差异有统计学意义（P＜0.05）。病毒学复发组随访结束时的HBsAg和HBVpgRNA滴度水平均明显高于停药时，差异有统计学意义（P＜0.05）。未复发组随访结束时血清中的HBsAg滴度水平明显高于停药时，差异有统计学意义（P＜0.05）。未复发组停药时及随访结束时血清中的HBVpgRNA滴度水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者停药时的肝功能ALT、AST水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；随访结束时，病毒学复发组的ALT、AST水平显著高于未复发组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组相关指标的比较（±s）

2.2 病毒学复发及预测因素分析

采用单因素COX回归分析筛选出影响患者停药后病毒学复发的2个相关因素，即停药时的血清HBVpgRNA阳性、HBsAg＞1000 U/ml（表2），同时对相关因素进行赋值（表3）。停药时血清中的HBVpgRNA阳性是导致CHB患者停药后出现病毒学复发的独立危险因素（P=0.045），与HBVpgRNA阴性患者相比，HBVpgRNA阳性患者停药后出现病毒学复发的风险明显升高（HR=3.99，95%CI：1.03～15.38）。停药时HBsAg＞1000 U/ml是导致CHB患者停药后出现病毒学复发的另一独立危险因素（P=0.000），HBsAg＞1000 U/ml的患者停药后出现病毒学复发的风险要明显高于HBsAg≤1000 U/ml患者（HR=20.81，95%CI：4.66～92.99）（表4）。

表2 单因素回归分析筛选出相关因素

表3 相关因素赋值

表4 多因素回归分析结果

2.3 乙肝病毒前基因组核糖核酸与乙肝病毒表面抗原预测病毒学复发的效能

ROC曲线显示，HBVpgRNA单独预测CHB患者停药后出现病毒学复发的曲线下面积（the area under the curve，AUC）为0.857（95%CI：0.71～0.95，P＜0.05），敏感性为65.00%，特异性为100.00%。HBsAg单独预测CHB患者停药后出现病毒学复发的AUC为0.886 （95%CI：0.75～0.96，P＜0.05），敏感性为90.00%，特异性为77.27%。HBsAg与HBVpgRNA联合检测的AUC为0.936，与两者单独预测的AUC值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），敏感性为90.00%，特异性为86.36%（表5、图1）。

图1 乙肝病毒前基因组核糖核酸与乙肝病毒表面抗原预测病毒学复发的ROC曲线图

表5 乙肝病毒前基因组核糖核酸与乙肝病毒表面抗原预测病毒学复发的效能

3 讨论

目前，在现有的国内外的CHB防治指南中并未提出能有效预测NAs安全停药的生物学标志物。既往主要依据HBeAg血清学转换、HBVDNA转阴、肝功能ALT复常等情况为患者提供停药建议，但复发率非常高。还有研究建议结合HBsAg检测情况评估患者停药的安全性，但结果并不理想。相关研究认为，CHB患者停用抗病毒药物时的HBsAg表达水平与停药后的病毒学复发无明显相关性。因此，寻找能有效预测NAs安全停药的生物学标志物指导CHB患者停药具有非常重要的临床意义。

HBVpgRNA是cccDNA最长的转录产物，其长度大约为3.5 kb。相关研究证实，cccDNA转录为HBVpgRNA的过程不会被NAs的治疗所阻断。在本研究中，42例经过4年及以上长期使用NAs治疗的CHB患者在停药时HBVDNA＜20 U/ml的情况下，仍有9例患者的HBVpgRNA检测阳性；同时，病毒学复发组在停药时基线及出现病毒学复发时血清中的HBVpgRNA和HBsAg滴度水平均明显高于未复发组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示在停药时如果CHB患者血清中还检测到HBVpgRNA存在，则肝细胞内仍然存在具有转录活性的cccDNA，预示停药后复发风险大。另一项研究也显示，相对于其他病毒学标志物，血清中的HBVpgRNA表达水平在NAs治疗的背景下可以更好地反映肝细胞内cccDNA的活性。小样本临床研究显示，停药时血清HBVpgRNA的表达水平可以预测停药后HBV反弹的情况。在本研究中，多因素COX回归分析显示，停药时血清中的HBVpgRNA阳性是导致病毒学复发的独立危险因素（HR=3.99，95%CI：1.03～15.38，P=0.045），停药时的HBsAg＞1000 U/ml是导致病毒学复发的另一独立危险因素（HR=20.81，95%CI：4.66～92.99，P=＜0.001），这与Fan等的研究结果相类似。Fan等对40例患者（初治时HBeAg阳性，使用恩替卡韦或替诺福韦治疗）进行停药后随访5.5年发现，停药时HBV DNA及HBV RNA检测均为阴性的患者4年后的临床复发比例（2/35）明显低于HBV DNA或RNA阳性的患者（32/ 102）（P=0.018）。但是，在另一项研究中却显示，HB-sAg≤100 U/ml可作为指导CHB患者安全停药的独立预测因子，而HBV RNA的表达水平不是预测患者停药后出现病毒学或临床复发的独立危险因素。这些研究结果的差异可能与停药时患者的HBeAg状态、HBsAg滴度水平以及HBV RNA检测的敏感性有关。此外，本研究的ROC曲线结果显示，HBVpgRNA表达水平对CHB患者停药后出现病毒学复发具有较好的预测价值，AUC为0.857，特异性为100%，但敏感性较差（仅为65.00%）；与HBsAg联合检测后，AUC高达0.936，敏感性也提高到90%，可以为CHB患者停药后出现病毒学复发的判断提供辅助依据。由此可见，停药时患者血清中的HBVpgRNA和HBsAg表达水平可以作为CHB患者停药后出现病毒学复发的预测因子，对指导CHB患者安全停药具有一定的临床参考价值。由于本研究不是多中心大数据临床研究，研究结论可能会存在一定的偏倚，关于HBVpgRNA 在CHB患者安全停药方面的价值仍有待更多的临床研究进一步证实。

综上所述，病毒学复发患者停药时的HBVpgRNA及HBsAg表达水平均显著高于未复发患者，HBVpgRNA阳性和HBsAg＞1000 U/ml是CHB患者停药后出现病毒学复发的独立危险因素，对预测CHB患者安全停药具有一定的临床价值。