洞庭青鲫肠道细菌分离及分泌胞外酶的能力分析

李 娜，马阿敏，王子悦，覃虹焱，姚 曲

（1.湖南文理学院 生命与环境科学学院，湖南 常德 415000；2.环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室，湖南 常德 415000；3.动物学湖南省高校重点实验室，湖南 常德 415000）

洞庭青鲫（Dongtingking Crucian Carp），属鲤形目、鲤科、鲤亚科、鲫属、鲫种，体高、背厚、个体大[1]，因背部颜色较深，故当地俗称黑壳子鲫鱼。洞庭青鲫生长快速、富含营养，味道好，回捕率很高[2-3]。由于营养价值高，市场需求量大，因此养殖发展前景十分广阔[4]。对于洞庭青鲫的研究主要集中在养殖、病害及遗传分析等方面[5-9]，有关肠道微生物的研究尚未见报道。本文研究洞庭青鲫肠道细菌的分离及其分泌胞外酶的能力，对提高洞庭青鲫的健康养殖、增加饵料利用率、促进生长均具有重要意义，也可为研究鱼类益生菌提供理论依据。

1 洞庭青鲫养殖环境

目前人工养殖的洞庭青鲫原种引自湖南省澧县北民湖，该湖是一个半封闭式的人造湖泊，调蓄容积15935万m3，属国家重点蓄洪垸区。该地年均气温16.5 ℃，平均日照时数1770.6 h，降水量1213 mm。洞庭青鲫亲鱼对培育池没有严格要求，目前该鱼已在数个省市推广养殖，但伴随着养殖密度及规模的扩大，病害问题也日益增多，制约着洞庭青鲫的健康发展[10]。

2 试验材料和方法

2.1 试验材料

淡水鱼类基础培养基（F W A）：牛肉浸膏2.50 g、葡萄糖1.00 g、酵母浸膏2.50 g、蛋白胨5.00 g、NaCl 5.00 g、KH2PO40.20 g、MgSO40.05 g。

实验鱼：网捕并随机采集的健康洞庭青鲫6尾，未分雌雄，2龄，健康活泼、挣扎有力、无病症。

2.2 洞庭青鲫肠道菌分离纯化

在实验室无菌条件下，处理洞庭青鲫肠道。将洞庭青鲫样本鱼放置在无菌白瓷盘中，先用无菌水冲洗鱼体表，再对洞庭青鲫样本鱼体表用75%酒精消毒。用无菌解剖剪刀小心解剖鱼体腹腔。从肛门后剪开，掀起腹壁，漏出肠道。轻轻剥离出洞庭青鲫样本鱼体肠道，首先清除肠道外壁表面脂肪组织，然后在无菌条件下，用无菌解剖剪刀将肠道剪开一个小纵切口，暴露出肠道内壁，用解剖剪刀背面轻轻刮去粘附于肠道内的粪便及食物残渣，最后用无菌水缓缓冲洗，除去残留物。将用上述方法处理好的所有洞庭青鲫样本鱼肠的前段、中段和后段分别称重，然后将6尾洞庭青鲫样本的所有前段肠道混合，准确称取10 g前段肠道样本备用。6尾洞庭青鲫样本的所有中段肠道和后段肠道也采用此方法制备待用样本。

2.3 菌株的简单染色和革兰氏染色

参照文献[11]进行。

2.4 分泌胞外酶菌种筛选

参照文献[12]配置好4种筛选培养基（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶），分别无菌浇注平板，待4种筛选平板凝固后，用接种针依次挑取菌株，点种在筛选板上，28 ℃培养箱中倒置培养一定时间后进行观察，测量并记录其水解圈直径和菌落直径[13-16]。

3 结果与分析

3.1 菌种分离纯化

通过稀释平板法筛选出健康洞庭青鲫前段肠、中段肠和后段肠中的菌落，共24种，依次编号1—24。洞庭青鲫肠分离菌株菌落在固体平板培养基上的生长符合常规细菌的生长特征，分离株菌落颜色以浅黄色和乳白色居多。详见表1—3。

3.2 简单染色与革兰氏染色结果

对从健康洞庭青鲫的前段肠、中段肠和后段肠筛选出的24株菌进行简单染色特性检测，油镜观察可见，24株分离纯化菌株中有5株为球状菌，占比20.83%，其中前段肠1株、中段肠1株、后段肠3株，其余19株均为杆状菌，占比79.17%，详见表4—6。

表2 洞庭青鲫中段肠菌落特征

表3 洞庭青鲫后段肠菌落特征

对从健康洞庭青鲫的前段肠、中段肠和后段肠筛选出的24株菌进行革兰氏染色检测，油镜观察可见，8株分离纯化菌株为革兰氏阳性菌（G+），占比33.33%，其余16株为革兰氏阴性菌（G-），占比66.67%。G-菌株数量多于G+菌株，详见表4—6。

3.3 分泌胞外酶菌株的筛选结果

本试验从健康洞庭青鲫肠道筛选出24 株菌，分泌胞外蛋白酶菌株（22/24）占比91.67%；分泌胞外脂肪酶菌株（18/24）占比75.00%；分泌胞外淀粉酶菌株（10/24）占比41.67%；分泌胞外纤维素酶菌株（13/24）占比54.17%。

经分泌胞外蛋白酶筛选培养基筛选出健康洞庭青鲫前段、中段、后段肠分别有6株、8株和8株细菌分泌蛋白酶；经分泌胞外脂肪酶筛选培养基筛选出健康洞庭青鲫前段、中段、后段肠分别有5株、7株和6株细菌分泌脂肪酶；经分泌胞外淀粉酶筛选培养基筛选出健康洞庭青鲫前段、中段、后段肠分别有1株、4株和5株细菌分泌淀粉酶；经分泌胞外纤维素酶筛选培养基筛选出健康洞庭青鲫前段、中段、后段肠分别有4株、3株和6株细菌分泌纤维素酶。

在分泌胞外蛋白酶的22株菌中，有G+菌7株（球菌1株，杆菌6株）；G-菌15株（球菌4株，杆菌11株）；分泌胞外脂肪酶的18株菌中，有G+菌6株（球菌1株，杆菌5株）；G-菌12株（球菌4株，杆菌8株）；分泌胞外淀粉酶的10株菌中，有G+菌1株（杆菌）；G-菌9株（球菌2株，杆菌7株）；分泌胞外纤维素酶的13株菌中，有G+菌5株（球菌1株，杆菌4株）；G-菌8株（球菌2株，杆菌6株）。洞庭青鲫肠道优势菌群以G-菌为主，杆菌数量高于球菌数量，说明洞庭青鲫肠道中G-菌分泌胞外酶能力强于G+菌。

从健康洞庭青鲫肠道中分离出24株菌，有22 株分泌胞外酶，分泌蛋白质酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶等4种胞外酶的菌株为13、17、22和23号菌；分泌3种胞外酶的菌株共12株，依次为2、6、7、8、10、12、14、15、16、20、21和24号菌；分泌2种胞外酶的菌株为4、5、11、18和19号菌等；9号菌仅分泌1种胞外酶；1号和3号2株菌不分泌胞外酶。详见表4—7。

表4 洞庭青鲫前段肠1～8号菌株分泌胞外酶活性

表5 洞庭青鲫中段肠9～16号菌株分泌胞外酶活性

表6 洞庭青鲫后段肠17～24号菌株分泌胞外酶活性

表7 洞庭青鲫各段肠分离菌分泌胞外酶能力统计

4 讨论

从健康洞庭青鲫肠道中分离出24株细菌，分泌胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的菌株分别为22株、18株、10株和13株，在菌株总数中的占比依次为91.67%、75.00%、41.67%和54.17%。健康洞庭青鲫肠道24株分离菌中，有4株菌能分泌4种胞外酶，12株菌能分泌3种胞外酶，5株菌能分泌2种胞外酶，1株菌能分泌1种胞外酶，2株菌不分泌胞外酶。分泌胞外酶的菌株数量从高到低依次是分泌胞外蛋白酶菌株＞分泌胞外脂肪酶菌株＞分泌胞外纤维素酶菌株＞分泌胞外淀粉酶菌株，其中，分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的菌株数量多于分泌胞外淀粉酶和胞外纤维素酶菌株数量。鱼类肠道的优势菌群一般为革兰氏阴性菌，阳性菌比例虽较小但也是肠道菌群的组成部分[13-14]。试验结果显示，在24株分离菌中，有8株为G+菌，占比33.33%；有16株为G-菌，占比66.67%，G-菌株数量多于G+菌株。具有分泌胞外酶能力的细菌以G-菌为主，表明洞庭青鲫肠道菌群分泌胞外酶能力方面，G-菌更具优势。

动物自身分离出的菌株用于该种属动物的微生态制剂更有助于菌株在宿主体内定植[15]。微生态制剂的独特功效越来越受到重视[16]，既能促进水生生物生长与繁殖，又能优化养殖水体环境。本试验中分泌胞外酶能力强的菌株可进一步研究其生长最适温度、pH、盐度、金属离子等，以期为作为益生菌添加到洞庭青鲫配合饲料中的应用提供参考。