布鲁氏菌BP26抗原胶体金试剂盒的研制及功能初试

王婷，张正雷，孙田华，张幸子，王彩霞，席仲兴，焦 磊

（兰州生物制品研究所有限责任公司，甘肃 兰州 730046）

布鲁氏杆菌（以下简称布氏菌）是革兰氏阴性胞内寄生菌[1]。布氏菌病是一种由布氏菌引起的人畜共患慢性细菌性传染病。该病在世界各国广泛流行，严重危害人类健康和畜牧业发展。因此，快速准确的诊断是控制该病的关键[2]。

细菌学分离培养是最可靠的布氏菌病检测方法，是检测布氏菌病的“金标准”[3]。但布氏菌的分离培养对实验室要求较高，培养周期长[4]，且该方法受很多因素影响导致阳性检出率较低，所以布氏菌病的实验室诊断多采用免疫学方法。最常用的有试管凝集试验（SAT）和虎红平板凝集试验（RBPT）[5]，两者具有操作简单、实验设备简易的优点，是我国目前常用的检测布氏菌病的方法，缺点是结果判定主观性较强、检测时间长、易出现漏检或假阳性[6]。而胶体金免疫层析法对样本检测量需求少、操作方便、反应时间短，适合于广大基层现场及大量检测样本的快速初筛[7]。

BP26抗原是一种强免疫原性的细胞间质蛋白，以其为检测抗原检测布氏菌病的准确率可达90%以上[8]。本研究基于BP26抗原并采用胶体金免疫层析法研制出布氏菌病诊断试剂盒，以期用于布氏菌病的快速检测，尤其是基层对该病的初筛。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 抗原及血清 重组布氏菌BP26抗原和兔抗BP26多抗血清均为兰州生物制品研究所有限责任公司制备。多抗血清由抗原免疫家兔制备。

1.1.2 仪器设备 HM3035型XYZ三维划膜喷金仪、CT300型自动裁条机均为上海金标生物科技有限公司产品，CM4000型切条系统为BIODOT产品，SORVALL RC-6 plus型离心机、Biofuge Primo R型离心机均为ThermoFisher产品，UV-2550型紫外可见分光光度计为日本岛津公司产品。

1.1.3 主要试剂及材料 氯金酸（HAuCl4·3H2O）、PEG20000、柠檬酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）均为Sigma公司产品，其他试剂均为国产。硝酸纤维素膜（德国SARTORIUS UniSart CN140），吸水滤纸（Whatman），聚酯纤维膜（VL98）、PVC板、干燥剂均为国产。

1.2 试验方法

1.2.1 制备胶体金溶液 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。配制新鲜的1%氯金酸溶液及1%柠檬酸三钠溶液备用，在500 ml蒸馏水中加入5 ml 1%氯金酸溶液煮至沸腾，再迅速一次性加入9 ml新配制的1%柠檬酸三钠溶液，混匀，继续煮沸，直至溶液呈现透明的酒红色，待冷却，4 ℃保存备用。观察胶体金溶液的物理性状，采用紫外可见分光光度计在波长400～600 nm范围内对制备的胶体金溶液进行扫描，测定其最大吸收峰值。

1.2.2 胶体金溶液标记BP26抗原的最佳标记pH确定 配制pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液，每隔0.2个pH为一个结合梯度，每管先加入100 μl磷酸盐缓冲液，再加入30 μl BP26抗原，振荡混匀，室温下静置反应20 min，再加入200 μl 10% NaCl溶液终止反应，观察颜色变化，颜色保持不变的最低pH，即为胶体金溶液标记BP26抗原的最佳标记pH。

1.2.3 胶体金溶液标记BP26抗原的最佳标记抗原量确定 准备1.5 ml离心管若干，分别加入已调整为最佳标记pH的磷酸盐缓冲液及胶体金溶液，各管加入BP26抗原量从6 μl至44 μl，每管间隔2 μl，振荡混匀，室温静置反应20 min。然后每孔加入200 μl 10% NaCl溶液，观察颜色变化，颜色保持不变的最小抗原量，即为胶体金溶液标记BP26抗原的最佳标记抗原量。

1.2.4 金标BP26抗原的制备 用氯金酸制备0.01%胶体金溶液，用已确定为标记BP26抗原的最佳p H 的磷酸盐缓冲液，再根据已确定的最佳标记量加入相应量的BP26抗原，用磁力搅拌器缓慢混匀，再加入0.05%的PEG20000后继续搅拌30 min。4 ℃条件下4000 r/min离心30 m i n，弃沉淀；上清液在4 ℃条件下9500 r/min离心45 min，小心吸取沉淀，沉淀用pH 6.7的磷酸盐缓冲液重悬，即为金标BP26抗原，4 ℃保存备用。

1.2.5 布氏菌BP26抗原胶体金试剂盒的组装硝酸纤维素膜（NC膜）上检测线（T线）包被BP26抗原，质控线（C线）包被兔抗BP26多抗，胶体金结合垫铺上金标BP26抗原，将胶体金结合垫、样品垫、包被XT线和C线的NC膜、吸水滤纸依次固定于PVC底板上，裁切成0.42 cm ×5 cm条状，装入特制的塑料卡盒内，再装入有干燥剂的铝箔袋中密封，即为用于检测布氏菌病的胶体金检测试剂盒。

1.2.6 胶体金试剂盒的判定方法 样品加量为100 μl，反应时间为15 min，T线和C线均显示红色条带判定为阳性；T线不显示红色条带，C线显示红色条带时判为阴性；C线不显示红色条带判为试剂盒失效。

1.2.7 试剂盒的兔多抗血清检测及重复性检测 使用3批试剂盒检测布氏菌兔抗BP26多抗血清，血清稀释倍数为1∶10000倍，通过试验结果判定试剂盒的灵敏度和重复性效果。

2 结果

2.1 胶体金溶液的制备

制备的胶体金溶液外观呈酒红色，经紫外可见分光光度计扫描发现其吸收峰在525 nm处，峰型狭窄，说明该胶体金颗粒均一，分散性好（图1）。

图1 胶体金溶液的紫外可见分光光度计扫描光谱图

2.2 胶体金溶液标记BP26抗原的最佳标记pH确定

经试验确定，最佳标记pH为6.7。

2.3 胶体金溶液标记BP26抗原的最佳标记抗原量确定

试验测得加入BP 26 抗原最低稳定量为16 μl/0.9 ml胶体金（BP 26 抗原蛋白含量为1.24 μg/μl），则最佳标记量为20 μl。

2.4 试剂盒的兔血清检测及重复性检测

使用3批试剂盒检测布氏菌兔抗BP26多抗血清，检测结果一致，说明试剂盒的重复性良好（图2）。

图2 兔抗BP26多抗血清检测结果

3 讨论与结论

胶体金免疫层析技术具有便捷、特异敏感、稳定性强、对设备要求不高、肉眼即可快速判定结果等特点，特别适合基层现场的快速初筛和应用[6,9]。BP26抗原为布氏菌细胞间质蛋白，作为布氏菌病血清学检测诊断抗原具有较好的特异性和较高的灵敏度[10]。本研究基于BP26抗原并采用双抗原夹心法建立了布鲁氏菌BP26抗原胶体金试剂盒，即将重组的布氏菌外膜蛋白BP26作为胶体金标记物，金标BP26抗原作为检测线（T线）及抗BP26兔多克隆抗体作为质控线（C线），该检测试剂盒操作简便，15 min即可检测出结果，样本用量少，操作过程污染机会少，且成本低廉，故可作为布氏菌病的初筛方法。