益脑通络颗粒对小鼠出凝血时间和大鼠凝血四项以及血细胞的影响

乌凯迪，张婷婷，宋莹，王振，李晓莹，周明博，陈阳燕，蒋希成

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

凝血系统由细胞和可溶性蛋白质组成，正常人体的生理性凝血是在身体血管损伤部位的止血过程。而血栓形成是指人体过度凝血进而导致不良心脑血管事件的过程，如心肌梗死、中风和静脉血栓栓塞等。

益脑通络颗粒是经名老中医陈景河所拟的“中风防治片”深入研究并更换剂型所创，全方由益母草、何首乌、葛根、川芎、杜仲、红花、泽泻7味药组成，具有活血化瘀、祛风通络、益精填髓等功效。本课题组对自拟方益脑通络颗粒进行临床前研究，在“上工治未病”和“未病先防、既病防变”的思想下，对健康大鼠和小鼠进行实验研究，观察凝血四项以及红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)以及红细胞压积(HCT)指标，以此判断益脑通络颗粒对于现实生活中部分人群存在的危险致病因素的调控作用，为后续的实验打好基础，同时旨在发现该药物对于凝血功能异常的预防作用，从而降低由凝血功能异常导致中风发病的风险。

1 材料

1.1 仪器和试药

电子天平(上海光正医疗仪器有限公司)；注射器、剪刀、秒表、玻璃毛细管(江苏省长丰医疗实业有限公司)；全自动血凝仪(北京普利生仪器有限公司，型号：C2000-A)；多用台式高速冷冻离心机(美国贝克曼公司，型号：X-22R)；益脑通络颗粒水溶液(方中各药均购自于哈药集团世一堂中药饮片有限公司)。

1.2 实验动物

ICR雄性小鼠40只，体质量18～22 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001。SD雄性大鼠20只，体质量220～240 g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(黑)2018-003，动物饲养室温度21～25 ℃，相对湿度60%～70%，每天光照12 h，自由摄食、摄水。

2 实验方法

2.1 动物分组及给药

将ICR雄性小鼠随机分为4组，分别是空白对照组、益脑通络颗粒低剂量组(9 g/kg生药)、益脑通络颗粒中剂量组(18 g/kg生药)、益脑通络颗粒高剂量组(36 g/kg生药)，每组5只，每天灌胃1次，每次0.4 mL，空白对照组给予等量蒸馏水，连续给药7 d。

将SD雄性大鼠随机分为4组，分别为空白对照组、益脑通络颗粒低剂量组(6 g/kg生药)、益脑通络颗粒中剂量组(12 g/kg生药)、益脑通络颗粒高剂量组(24 g/kg生药)，每组5只，每天灌胃1次，每次2 mL，空白对照组给予等量蒸馏水，连续给药7 d。

2.2 益脑通络颗粒对小鼠出血时间的影响

每组取小鼠5只，于末次给药后1 h，在正常饲养温度下，用剪刀在距离鼠尾约3 mm处剪去小鼠尾巴，血液自行流出后开始计时，每隔10 s用滤纸轻拭血滴1次，直至拭后不再出血为止，停止计时，所记录时间为出血时间[2]。

2.3 益脑通络颗粒对小鼠凝血时间的影响

每组取小鼠5只，于末次给药后1 h，在正常饲养温度下，用玻璃毛细管插入小鼠眼内眦球后静脉丛，从血液流入玻璃毛细管开始计时，至血液充满整个毛细管为止，取出玻璃毛细管，平放在实验台上，每隔10 s折断玻璃毛细管5 mm，并缓慢左右拉开，观察折断面是否有血凝丝出现，重复多次，直至有血凝丝出现，立刻停止计时，所记录时间为凝血时间[3]。

2.4 益脑通络颗粒对大鼠凝血四项的影响

每组取大鼠5只，于末次给药后1 h，将其麻醉，用柠檬酸钠(9∶1)真空采血管腹主动脉取血2 mL，放入离心机中，3 000 r/min，离心10 min，分离血浆，用全自动血凝仪测定凝血四项(APTT、PT、TT、FIB)[4]指标。

2.5 益脑通络颗粒对大鼠血细胞分析的影响

每组取大鼠5只，于末次给药后1 h，将其麻醉，用柠檬酸钠(9∶1)真空采血管腹主动脉取血2 mL，用全血自动分析仪测定各组大鼠红细胞、血红蛋白以及红细胞压积[5]。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 益脑通络颗粒对小鼠出血时间的影响

小鼠灌胃7 d，与空白对照组比较，益脑通络颗粒低、中、高剂量组均可以显著延长小鼠出血时间(P<0.01)，见表1。

表1 益脑通络颗粒对小鼠出血时间的影响

3.2 益脑通络颗粒对小鼠凝血时间的影响

小鼠灌胃7 d，与空白对照组比较，益脑通络颗粒低、中、高剂量组均可以显著延长小鼠凝血时间(P<0.01)，但益脑通络颗粒中、高剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表2。

表2 益脑通络颗粒对小鼠凝血时间的影响

3.3 益脑通络颗粒对大鼠凝血四项的影响

大鼠灌胃7 d进行凝血四项实验，结果显示，与空白对照组相比较，针对于APTT，益脑通络颗粒低剂量和中剂量组存在显著差异(P<0.01)；而高剂量组并无显著差异(P>0.05)；在PT方面，低剂量组无显著差异(P>0.05)，但中、高剂量组表现出极显著的差异性(P<0.01)；在TT的数据上，只有中剂量组存在了显著的差异性(P<0.05)，其他两组差异均无统计学意义(P>0.05)；在FIB中，低剂量组存在显著差异(P<0.05)，中剂量组和高剂量组具有极显著的差异性(P<0.01)。以上实验结果说明了益脑通络颗粒具有延长APTT、PT以及TT的作用，且可以降低血液中FIB，从而发挥抗凝血的作用，结果见表3。

表3 益脑通络颗粒对大鼠APTT、PT、TT、FIB的影响

3.4 益脑通络颗粒对大鼠血细胞的影响

经过对灌胃后的大鼠取腹主动脉血，进行红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)分析。与空白对照组相比，在RBC方面，益脑通络颗粒低剂量组和中剂量均无显著差异(P>0.05)，而高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)；在HGB方面，低剂量组和中剂量组虽然在平均水平上可以看出有些变化，但两组差异均无统计学意义(P>0.05)，高剂量组存在显著的差异性(P<0.05)；在HCT数据上，只有高剂量组表现出极显著的差异性(P<0.01)，结果见表4。

表4 益脑通络颗粒对大鼠血细胞的影响

4 讨论

针对于凝血功能的重要性，在临床上医生常常以凝血功能检测结果对患者进行病情评估，凝血四项是临床上常见评价凝血功能的检测之一，凝血功能异常常常会导致瘀血。通过对小鼠出血时间和凝血时间的研究发现，益脑通络颗粒可以有效地延长出、凝血时间，具有显著的活血效果。其中，研究人员通过对益母草提取物进行抗血小板聚集实验，显示该药物对花生四烯酸和二磷酸腺苷诱导兔的血小板聚集具有潜在的抗聚集作用，对TNF-α的表达有抑制作用[6]。方中所用葛根具有扩张血管、抑制血小板聚集的作用，能够防止动脉粥样硬化[7]。而红花在《新修本草》中记载：“红花治口噤不能语, 血结及产后诸病。”其功效为活血通经、散瘀止痛[8]。有研究表明，红花的有效成分可以明显延长凝血时间，抑制血小板聚集，同样降低了血栓形成的风险，对于预防中风起到了促进作用[9]。CAI等[10]通过研究显示川芎嗪可显著降低大鼠全血黏度和血小板聚集性，此外，李力[11]通过川芎嗪对血小板进行体外实验，表明了川芎嗪具有显著抑制ADP诱导的血小板聚集的能力。这两个实验均表明，川芎也具备抗血小板聚集作用，降低血栓发生概率的功效。

相关资料显示，中风患者不同凝血指标的改变或早于影像学上的改变，这些指标的改变可进一步激活凝血系统，引起抗凝、凝血、纤溶水平变化[12]。而凝血四项是展现凝血功能的主要指标，其中APTT和PT分别反映内源性凝血系统和外源性凝血系统的状况；FIB是体内参与凝血的一个重要因子，其水平升高代表着血液可能属于高凝状态；TT主要反映FIB转为纤维蛋白的时间[13]。

本实验中，通过对正常大鼠凝血四项的检测发现，益脑通络颗粒可以明显延长大鼠的APTT、PT以及TT，表明益脑通络颗粒能同时抑制内源性和外源性凝血因子的活性，具有抗凝血的作用；对于FIB，益脑通络颗粒也能使其呈现明显的下降趋势，同样起到了抗凝血作用。实验结果显示，益脑通络颗粒中剂量组在各项指标上与空白对照组比较均呈显著差异，为临床用药量提供了新思路。有研究表明红细胞数值的异常增多，可能伴随着血红蛋白、红细胞压积、血小板增多，进一步造成头晕、头胀等症状，严重的可能会引起心肌梗塞、脑血栓等血栓类疾病[14]。血红蛋白数目的异常增多，会导致人体血液黏稠度上升，血管类疾病的风险也会大大增加[15]。本文探讨了益脑通络颗粒对于血细胞中的红细胞等数据的影响，通过与空白对照组相比，益脑通络颗粒高剂量组别展现出较好的降低红细胞、血红蛋白以及红细胞压积的能力，对于预防凝血功能异常起到了积极的作用。

综上所述，益脑通络颗粒具有较好的抗凝血功能，活血化瘀功效较为显著，同时为预防由凝血异常引起的相关疾病提供了可能。