基于UPLC-Q/TOF-MS技术的东北黄精、多花黄精及滇黄精成分分析

杨波，黄金月，郑时嘉，唐檬，马鹰，夏念桐，于纯淼，王志刚*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.天问山农业综合开发股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 150300)

黄精(Polygonatirhizoma)收录于2020年版《中华人民共和国药典》一部，为百合科黄精(Polygonatumsibiricum)、多花黄精(Polygonatumcyrtonema)及滇黄精(Polygonatumkingianum)的干燥根茎[1]，兼具药用、食疗、外敷[2]、观赏[3]等功效价值，收载于最新版《按照传统既是食品又是中药材的物质目录》中[4]。黄精多糖、皂苷、蒽醌、黄酮及氨基酸等多种有效成分，具有补气、养阴、止饥、除风湿、耐寒暑、抗衰老、抗炎抗菌、增强免疫力等活性[5-6]，可用于预防或治疗阿尔兹海默病、糖尿病、脂肪肝、动脉粥样硬化等病症[7-8]。黄精亦是传统中药材，分布于关药、北药、南药、云药及贵药，其中关药指东北地区，主要分布于黑龙江、吉林、内蒙古；北药指华北地区，主要分布于山西、河北，盛产黄精；南药指长江以南，南岭以北地区，主要分布于江西、湖南，盛产多花黄精；云药指云南省，贵药指贵州省，盛产滇黄精[9]。随着黄精繁殖培育势头正盛，黄精保健茶、冲调食品和即食食品等保健品系列也纷纷兴起，各产地黄精质量良莠不齐，黄精的化学成分分析及相应的质量控制方法制订至关重要。

黄精中所含化学成分是衡量各产地黄精质量标准的重要指标，目前关于各产地黄精成分分析的研究主要有高效液相检测、液质联用、气质联用等，但针对药典中3种基源黄精的全成分分析却未见报道[10]。超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用(UPLC-Q/TOF-MS)因灵敏度高、检测速度快等绝对优势，成为近年来复杂基质全成分分析的最有效方法之一。本研究以超声波辅助提取法对黄精干燥根茎进行样品前处理，以UPLC-Q/TOF-MS对黄精、多花黄精及滇黄精进行全成分分析，为进一步制订黄精质量标准、促进黄精资源开发和药食两用提供参考[11]。

1 材料

1.1 仪器

超高效液相色谱(Waters AcquityTM UPLC)-质谱(Waters SynaptTMG2-Si MS)联用仪(美国沃特世科技有限公司)；Masslynx V4.1工作站(美国沃特世科技有限公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Thermo Scientific Finnpipette F3单通道移液器(规格20～200 μL,美国赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2 试剂和药材

分析纯甲醇(天津市富宇精细化工有限公司)；色谱级乙腈(德国Merck技术有限公司)；亮氨酸脑啡肽(美国SIGMA技术有限公司)；黄精生药材(批号：20210813，天问山农业综合开发股份有限公司)；多花黄精生药材(批号：20210811，湖南天地农业发展有限公司)；滇黄精生药材(批号：20210723，四川福曦堂生物科技有限公司)。黄精生药材经黑龙江中医药大学药学院孙慧峰教授鉴定为黄精、多花黄精及滇黄精。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

黄精根茎除须根，洗净，切片，置60 ℃烘箱中干燥[12]。取干燥后的黄精切小块，粉碎，过4号(60目)筛，称取粉末2 g，置50 mL具塞锥形瓶中，加80%甲醇[13]20 mL，称重，超声提取40 min，提取2次，放冷至室温，称重，补足失重80%甲醇，过滤，合并2次滤液，蒸干，浸膏用少量甲醇复溶[14]，并转移至10 mL容量瓶中，定容至刻线，置4 ℃冰箱中冷藏备用。临用前，过0.22 μm微孔滤膜至进样杯中，供UPLC-Q/TOF-MS分析。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3(1.8 μm 2.1 mm×100 mm Column)；流动相 A：0.1%甲酸-乙腈，B：0.1%甲酸-水，梯度洗脱(0～5 min，10%～25%A；5～10 min，25%～50%A；10～20 min，50%～85%A；20～30 min，85%～100%A)；色谱柱温度：40 ℃；流速：0.3 mL/min；进样体积：5 μL[15]。

2.2.2 质谱条件

采用全扫描和全信息串联质谱(MSE)模式扫描，电喷雾(ESI)离子源，以centriod模式分别在正、负离子模式下采集数据，并采用美国Waters集团公司独家专利Lockspray校正系统进行在线亮氨酸-脑啡肽(Leueine-enkephalin，[M+H]+=556.277 1；[M-H]-=554.277 1)质量校正，溶液浓度为1 ng/μL，流速为10 μL/min，扫描范围：50～1200 Da。本实验中正、负离子模式下的质谱具体参数设置值：锥孔电压40 v；毛细管电压3 kv；离子源温度210 ℃；脱溶剂气流量600 L/h；锥孔气体流量50 L/h。

2.3 供试品溶液的UPLC-Q/TOF-MS分析

取“2.1”项下供试液，按“2.2.1”“2.2.2”项下条件检测。

2.4 数据收集与处理

MSE数据首先通过MassLynx V4.1工作站进行色谱峰的初步提取和预处理，然后利用MassLynx中的“Elemental Composition”工具获取质谱信息，并查询Chemspider、Pubchem、TCMSP、HMDB、KEGG、MassBank等数据库。在此仅以PubChem数据库举例说明，通过MassLynx V4.1工作站获取初步的分子式、分子质量、误差(ppm)和碎片离子等质谱信息，选择ppm值最小的分子式，进入Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，通过比对二级质谱碎片离子相关信息选取最符合的化合物。再结合 PubMed、CNKI等网站，参考中英文相关文献，建立黄精化合物数据库，再次根据碎片离子信息与数据库进行比对，进行化学成分的初步鉴定。

3 结果与分析

3.1 UPLC色谱分析

黄精药材中成分种类众多，若提取方法或试剂选取不恰当，可能会造成某类成分严重缺失。目前提取方法多为超声波提取法、水浴回流法，水提取等，经前期验证，水提取法提取成分较单一，多为多糖类，且水溶液易霉变不易保存；水浴回流法费时费力，最终确定以超声提取法作为供试品溶液制备方法。提取溶剂多为乙醇、甲醇等，经查阅文献，乙醇提取主要成分为皂苷、黄酮类，不具有全面性。本研究用甲醇作为提取溶剂，结合超声波法对3种黄精全成分进行有效提取，再采用UPLC/MS对其全成分进行表征。东北黄精、多花黄精及滇黄精色谱图见图1～图3。

注：A.正离子模式色谱图；B.负离子模式色谱图。

注：A.正离子模式色谱图；B.负离子模式色谱图。

注：A.正离子模式色谱图；B.负离子模式色谱图。

由图1、2、3可知，3种黄精中的大量成分得到表征，且主要色谱峰分离较好，对比各图，发现不同产地3种黄精化学成分差异存在差异，其中检测到的色谱峰数，东北黄精最多、多花黄精次之、滇黄精最少。

3.2 MS分析

按上述方法采集的MSE数据，获取二级质谱碎片离子信息，与相关中英文文献[2-16]资料比对，对“3.1”项下各色谱峰进行结构鉴定。并以黄精中41号色谱峰为例，说明分析步骤。图4为41号峰的一级、二级质谱图，在一级质谱图中，m/z 1107的峰是准分子离子([M-H]-)峰，结合“Elemental Composition”数据处理及PubChem、MassBank、KEGG等网站查询，基本确定该化合物为三萜皂苷类的人参皂苷Rb1，检测到m/z 945，783，621，459的碎片峰，图5为人参皂苷Rb1最可能的裂解途径。

注：A.一级质谱图；B.二级质谱图。

图5 黄精41号峰推测的质谱裂解途径

在30 min内，东北黄精检测到57个化合物，负离子模式下鉴定了55个化合物，正离子模式下鉴定了33个化合物。其中包括17个甾体皂苷类成分，14个黄酮类成分，5个三萜皂苷类成分，3个多糖及苷类成分，3个甾醇类成分，2个氨基酸类成分，2个生物碱类成分，1个香豆素类成分；多花黄精检测到42个化合物，正离子模式下鉴定了34个化合物，负离子模式下鉴定了26个化合物。其中包括15个黄酮类成分，8个甾体皂苷类成分，4个多糖及苷类成分，3个三萜皂苷类成分，3个氨基酸类成分，2个甾醇类成分，1个生物碱类成分，6个其他；滇黄精检测到30个化合物，正离子模式下鉴定了23个化合物，负离子模式下鉴定了18个化合物。其中包括11个黄酮类成分，6个甾体皂苷类成分，4个多糖及苷类成分，3个三萜皂苷类成分，2个生物碱类成分，1个氨基酸类成分，1个羧酸类成分，1个内源性核苷类成分，1个其他。3种黄精的质谱及鉴定结果见表1～表3。

表1 东北黄精化学成分的质谱信息

表2 多花黄精化学成分的质谱信息

4 讨论

本实验采用超声波提取法以甲醇提取3种黄精药材，采用UPLC/MS表征分析样品所含化学成分，结果表明，3种黄精所含化学成分差异明显，所建立的方法可用于区分3种黄精。此前已报道的黄精主要成分分析方法存在检测成分少，检测方法不完善等诸多问题。余亚鸣等[17]采用HPLC-MS法检测了单一黄精中的化学成分，黄精品种少且方法灵敏度低；杨兴鑫等[18]利用多元统计分析检测3种基源黄精中化学成分，比较了3种黄精化学成分差异性，但未对化学成分进行结构鉴定。前期本课题组测定的东北黄精中总皂苷、总黄酮含量多于多花黄精及滇黄精[19]，此次研究发现东北黄精中化学成分种类也明显多于多花黄精及滇黄精，多成分含量及种类体现出了东北黄精的质量优越性，本研究为东北黄精道地药材资源和保健食品开发提供重要参考。