祛痰化瘀中药复方对心房颤动模型大鼠心电图及黏附分子P-Selectin、E-Selectin的影响

吴启华，宫丽鸿，肖福龙

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110033；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032)

心房颤动(Atrial Fibrillation，AF)是最常见的慢性持续性心律失常，由于心房不协调的电活动而引起。我国流行病学调查显示，心房颤动的发病率约为0.77%，随着年龄增大而逐步增加[1]。AF可诱发心功能不全、脑栓塞及周围血管栓塞，具有较高的致残率和致死率，是当前临床较为棘手的心血管疾病。

近年来，大量研究证明炎症反应、氧化应激以及血栓的形成在房颤纤维化、电重构以及不良预后中起到重要驱动作用，黏附分子的作用与上述发病机制形成息息相关[2]。黏附分子在参与细胞间的识别、活化、信号转导以及细胞的伸展与运动中起着重要作用，是一系列人体生理和病理过程如炎性反应、免疫应答、凝血、肿瘤细胞转移、愈合创伤等的分子基础[3]。赵爽等[4]研究表明，氧化应激时血管细胞黏附分子、P-选择素及E-选择素的表达水平明显增加，即氧化应激介导黏附分子的活化与升高。而选择素为黏附分子的一种，是一类异亲型结合、Ca2+依赖的细胞间黏着分子，可与特异糖基识别并结合，主要参与白细胞、血小板与血管内皮细胞之间的识别与黏着，包括L-选择素、P-选择素(P-Selectin)和E-选择素(E-Selectin)。

本实验采用Ach-CaCl2混合液尾静脉注射的方式进行大鼠AF造模，通过记录大鼠心电图AF的持续时间、心房肌细胞超微结构变化观察祛痰化瘀中药复方的疗效，并进一步检测AF大鼠血清黏附分子P-Selectin、E-Selectin含量以探讨祛痰化瘀中药复方的作用机制，为AF的中医治疗提供了有效的思路和方法。

1 材料

1.1 动物

雄性SPF级SD大鼠60只，体质量(350±50)g，购买于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物合格证号：SYXK(辽)2013-0009。饲养于辽宁中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室，高脂饲料喂养，动物实验符合辽宁中医药大学实验动物伦理委员会标准，实验动物伦理审查编号：21000042021021。

1.2 药物

祛痰化瘀中药复方组成为桂枝6 g，炙甘草10 g，甘松10 g，龙骨25 g，牡蛎25 g，熟三七2 g，柴胡10 g，枳壳10 g，白芍10 g，僵蚕5 g，丹参15 g，竹茹10 g，陈皮15 g，半夏10 g，桑寄生10 g，由辽宁中医药大学附属医院熬制成100 mL/袋；盐酸维拉帕米片(天津市中央药业有限公司，国药准字H12020051)，规格 40 mg/片。

1.3 试剂

氯化乙酰胆碱(Ach)(源叶生物科技有限公司,S30170-5g，CAS#60-31-1，分子式C7H16CINO2)；无水氯化钙(CaCl2)(源叶生物科技有限公司,S24110-500 g，CAS#10043-52-4)；10%水合氯醛溶液(飞净生物科技有限公司，规格：100 mL)；大鼠P选择素试剂盒、大鼠E选择素试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司)。

1.4 仪器

PowerLab 15T多导电生理记录仪(上海埃德仪器国际贸易有限公司，型号：mL4818)；哺乳动物类手术器械一套；精密电子天平(丹佛仪器北京有限公司，京制00000249号)；SIS透射电镜数字摄像头(TEM CCD Camera)(德国EMSIS，型号：MORADA)；酶标仪(Model680，Bio-Rad，美国)。

2 方法

2.1 造模方法与分组

60只雄性SD大鼠随机分为空白组(Control组)10只和造模组(Model组)50只，本实验参照陈春林《大鼠心房颤动模型的建立》[5]中造模方法，连续7 d经大鼠尾静脉注射Ach(66 μg/mL)-CaCl2(10 mg/mL)混合液制备AF大鼠模型，按0.1 mL/100 g计算给药体积。

造模第7天，所有大鼠称体质量，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)进行麻醉。连接PowerLab 15T多导电生理记录仪，测量Ⅱ导联心电图，以心电图中出现f波、P波消失，P-R间期绝对不等为AF发生的标志，以P波出现、f波消失为AF终止标志，计算出AF持续时间。将造模成功的50只大鼠随机分成模型组(Model组)、中药高剂量组(High dose组)、中药中剂量组(Middle dose组)、中药低剂量组(Low dose组)、维拉帕米组(Verapamil组)，每组10只。

2.2 药物干预

造模成功后第2天灌胃，给药剂量参考徐叔云主编的《药理实验方法学》[6]中关于人与动物按体表面积的等效剂量比值(1∶6.25)系数折算，中药复方高、中、低剂量组分别给予41.25、20.63、10.31 g·kg-1·d-1灌胃，Verapamil组给予维拉帕米片25 mg·kg-1·d-1灌胃，正常组与模型组给予生理盐水灌胃，连续给药2周。期间仍持续尾静脉注射Ach-CaCl2，于灌胃1 h后进行。

2.3 检测指标与方法

2.3.1 心电图测量大鼠AF的持续时间

大鼠禁食不禁水12 h，称体质量，采用水合氯醛麻醉。连接并测量Ⅱ导联心电图，动态观察5 min。

2.3.2 透射电镜观察大鼠心房肌细胞超微结构

开胸暴露心脏后，用移液枪抽取戊二醛固定液，滴入活体组织上，剪取心脏，将心房肌修剪成1 mm3左右的小块，放入盛有1 mL 4%戊二醛固定液的EP管中待用。

2.3.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清P-Selectin、E-Selectin的含量

记录心电图后，沿腹正中线向两侧剪开皮肤，暴露腹腔，进行腹主动脉采血,2 000 r/min离心10 min，ELISA法检测各组大鼠血清P-Selectin、E-Selectin的含量，按试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测OD值并计算浓度。

2.4 统计方法

3 结果

3.1 各组大鼠心电图AF持续时间比较

造模后，所有大鼠均出现明显房颤心电图，造模成功率100%。与Control组比较，造模组均出现典型的AF(P<0.01)；与Model 组比较，用药后大鼠AF的持续时间均明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.01)，组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1～2。

图1 正常大鼠心电图

表1 各组大鼠AF持续时间比较

3.2 各组大鼠心房肌细胞超微结构变化

透射电镜结果显示，Control组大鼠心房肌细胞的肌小节完整清晰，“Z”带排列整齐连贯，I带清晰可见，肌丝排列整齐紧密，线粒体结构正常，线粒体嵴结构完整。Model 组大鼠心房肌细胞的肌小节断裂，“Z”带不连续，排列混乱，“I”带模糊不清，心肌细胞肌丝溶解断裂，出现空隙，线粒体肿胀、增多，甚至破裂，嵴断裂溶解，聚集在一起，呈空泡样改变。High dose组、Middle dose组、Verapamil组大鼠心房肌细胞的肌小节轻微断裂，排列相对整齐，肌丝稍有溶解，线粒体稍有肿胀、增多，但嵴溶解明显减少，结构相对完整。Low dose组大鼠心房肌细胞的肌小节断裂，“Z”带不连续，排列不整齐，“I”带模糊不清，仍有线粒体肿胀、增多，嵴断裂溶解，个别线粒体结构不完整。见图3。

图2 房颤发生时心电图

图3 各组大鼠心房肌细胞超微结构变化(透射电镜，×10 000)

3.3 各组大鼠血清P-Selctin、E-Selectin含量比较

与Control组比较，Model组大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量显著升高(P<0.01)；与Model组比较，中药复方组大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量均明显降低(P<0.01)；High dose组、Middle dose组较Low dose组降低更为显著(P<0.05)，Verapamil组大鼠血清P-Selectin含量未见明显改善(P>0.05)；High dose组、Middle dose组、Verapamil组大鼠血清E-Selectin含量均明显降低(P<0.01)，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，而Low dose组大鼠血清E-Selectin含量未见明显改善(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量比较

4 讨论

在中医学中，房颤属于“心悸”“怔忡”等范畴。成无己《伤寒明理论·悸》曰：“其停饮者，由水停心下……水既内停，心不自安，则为悸也”[7]。《诸病源候论》所言：“风惊悸者，由体虚，心气不足，心之府为风邪所乘，或恐惧忧迫，令心气虚”。故此中药复方针对的心房颤动的发病机理为内有痰瘀之实，久则化火生风，风邪挟痰瘀扰动心之脉络。本方在温胆汤基础上进一步创新化裁而来，《医学入门》曰：“心与胆相通，心病怔忡，宜温胆汤”。方中竹茹、陈皮、半夏、苦参、丹参、僵蚕为君药，半夏、陈皮有“二陈”之意，燥湿化痰不言自明，竹茹清热燥湿、化痰降气共同调畅脾胃，使痰湿自化，丹参养血活血、祛瘀通络，配伍僵蚕取其息风通络之功效，以抑制“风动”之象；柴胡、枳壳、白芍、桑寄生为臣，共奏调畅气机，交通心肾之效；白芍养阴柔肝、养血，抑制肝风，桑寄生入肝肾经，具有祛风、补肝肾的功用，二药使气机升降得畅，心肾水火既济。心脏的正常搏动有赖于心之阳气的推动和温煦，是心搏跳动之源头动力，论遂佐以桂枝甘草龙骨牡蛎汤意在振奋心阳，温养心神，恢复正常窦房结功能[8]。甘松为使，行气开郁，醒脾健胃，以化痰饮。全方共奏清热祛痰化瘀、熄风定悸安神功效。

选择素-P又称CD62P，是分子量为140 kDa的跨膜糖蛋白。马晓芸等[9]研究发现，在基因水平上，P-Selectin的2123C>G、-1817T>C与房颤合并血栓具有明显相关性。MIANMINO等[10]认为P-选择素介导血小板黏附于内皮细胞, 激活中性粒细胞以及二者的黏附、聚集，释放血管活性物质和氧代谢产物, 导致血管收缩, 启动血栓形成，是血小板活化的标志。同时，因为P-选择素对中性粒细胞具有趋化作用，还能上调单核细胞表达，并可导致单核细胞在损伤血管内皮的聚集，激活炎症细胞，扩大局部炎症反应[11]。选择素-E，又称CD62E，是分子量约为115 kDa的糖基化单链跨膜蛋白。有研究显示，当人体内有严重的炎性反应出现时，血清中E-Selectin会出现高水平表达，特别在心血管疾病中[12]。E-Selectin只在内皮细胞上表达，可使激活的内皮细胞与中性多形核细胞、单核细胞、淋巴细胞黏附，反应机体炎症反应和内皮功能，与房颤的发生发展密切相关。本实验研究中，所有用药组大鼠AF的持续时间均有不同程度降低(P<0.05)，用药干预后肌丝排列相对整齐，线粒体结构相对完整，Model组大鼠血清P-Selectin、E-Selectin含量均升高(P<0.01)，用药后二者含量出现不同程度的降低(P<0.01)，说明本中药复方抑制了房颤过程中炎症细胞和血小板的聚集，从而抑制了炎症反应和血栓前状态。

现代药理学研究显示，温胆汤可能通过降低血脂、改善血中化学成分、增加红细胞和血小板表面电荷，从而降低两者之间的聚集，改善血液高凝状态[13]。杨溶海等[14]研究表明丹参多酚酸盐具有降低临床急性心肌梗死患者血清中P-Selectin、E-Selectin的水平，可能机制为通过抑制血小板聚集、抗血栓形成、清除自由基、抗氧化、调节血脂代谢与内皮细胞功能[15]，进而达到稳定斑块的作用。半夏可降低血液黏稠度、抑制红细胞聚集和抗心律失常[16]；黄芩可改善血管,预防血栓的形成;三七主要活性成分三七总皂苷可调节COX2表达、抑制 COX1 表达、降低血小板上清液 TXB2 浓度，抑制 TXA2 途径来抗血小板；保护内皮细胞抑制血小板黏附[17]。

综上所述，祛痰化瘀中药复方可降低大鼠AF的持续时间，改善心肌细胞超微结构的损伤，降低AF大鼠血清中P-Selectin、E-Selectin的含量，抑制血小板和炎症细胞等活化和聚集，为AF的中医治疗提供新的治疗思路和方法。