miR-124-3p靶向Axin1 调控糖尿病骨质疏松成骨的研究

王斌 麦彩园 汪志中 李新旭 董俊球*

1.佛山市三水区人民医院骨科，广东 佛山528100 2.广东省妇幼保健院产科，广东 广州510010

2型糖尿病患者在中国的发病年龄逐渐变小[1]。糖尿病患者常见的一种并发症为骨质疏松。在骨质疏松的糖尿病患者中，骨微结构受损，骨量减少和脆性骨折增加[2]。越来越多的证据表明，糖尿病会增加患骨质疏松症骨折的风险[3]。因此，必须开发有效的防治骨质疏松症的措施来预防和干预[4]。

近年来，miRNA对BMSCs及成骨细胞分化的影响已成为热点问题, 史宏利等[5]研究人BMSCs中miRNA的表达差异，体外研究证实miR-124-3p对BMSCs向成骨细胞分化起调控作用，在老年小鼠骨组织中也发现miR-124-3p表达上调，该miRNA在骨组织的退化及骨质疏松形成和发展过程中发挥较大作用。研究[6]表明，Wnt通路调节干细胞作用于成骨细胞分化，在糖尿病骨质疏松症的发生过程中发挥重要作用。BMSCs可激活骨诱导基因然后经过Wnt通路调控诱导骨分化[7]。Wnt的激活可以促进成骨，增加骨量，并促进骨的愈合，Axin1(axis inhibitor factor 1，轴抑制蛋白1)是Wnt/β-catenin通路里Wnt下游一个抑制骨形成的因子，它是一种多功能的构架蛋白，在许多重要的信号传导通路中扮演着重要的角色。它参与调节许多细胞功能，包括细胞增殖、干细胞再生、细胞凋亡、胚胎发育、代谢、分化和细胞运动[8]。

本研究中建立糖尿病诱导的骨质疏松模型，分析miR-124-3p通过Wnt通路的因子Axin1 对成骨分化产生的影响。

1 材料和方法

1.1 仪器及试剂

PCR检测系统、紫外分光光度计、流式细胞仪：Bio-Rad公司，美国。荧光素酶报告检测系统、骨密度仪：Progmega公司，美国。Trizol、RT-PCR试剂盒(M-MLV)：碧云天公司，中国。ALP试剂盒、茜素红染色试剂盒、载体：Bio-Rad公司，美国。柠檬酸盐缓冲液、链脲霉素(STZ)：研谨生物科技有限公司，中国。ELISA试剂盒：Takara公司，中国。培养液、Percoll液、胰酶、抗体、成骨诱导液、LipofectamineTM2000：无锡百迈格生物科技有限公司，中国。碱性磷酸酶染色试剂盒、茜素红染色溶液、miR-124-3p模拟物：Bio-Rad公司，美国。胎牛血清、p-MiR report质粒、293 T细胞：Invitrogen公司，美国。

1.2 实验对象

本研究方案经由佛山市三水区人民医院的伦理委员会审查通过。从中山大学实验动物中心购买糖尿病大鼠模型-SPF级SD雌性大鼠20只，年龄7～10周，体重130～200 g，分为对照组和实验组，每组10只。对照组腹腔注射柠檬酸盐缓冲液，实验组注射新鲜制备的2 %链脲霉素(STZ)(60 mg/kg)持续1周。空腹12 h后测量血糖，浓度为16.67 mmol/L，表明该模型的成功建立。所有大鼠于8周后被处死，摆锯于股骨近端1/3处截断，采集大鼠的骨髓组织及外周静脉血清，并储存在-80 ℃。

1.3 实验过程

20只大鼠分组为对照组10例、实验组10例，经过药物注射，ELISA检测血生化指标，骨密度仪测骨密度。BMSCs培养，流式细胞学鉴定。检测对照组和实验组miR-124-3p mRNA的表达。过表达miR-124-3p(模拟物)7、14、21 d，检测ALP、茜素红染色成骨能力。第7天检测miR-124-3p mRNA表达水平。实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，分为高糖组和低糖组，检测中Axin1 mRNA水平。构建载体，与模拟物共转染，荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1靶向结合。将实验组BMSCs分为高糖组和低糖组，检测实验组BMSCs高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。检测实验组模拟物在高糖组及低糖组miR-124-3p、Runx2 mRNA的表达及茜素红染色和ALP染色结果。

1.4 ELISA检测生化指标

ELISA检测糖尿病模型大鼠的血清生化指标，β 胶原降解产物(β-CTX)、骨钙素(OC)、硬化素(SOST)评估骨的吸收和形成；总三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)评估脂质代谢；空腹血糖FPG和血红蛋白A1C-HBA1C评估葡萄糖代谢；骨密度仪检测大鼠腰椎骨密度(g/cm2)。验证糖尿病骨质疏松大鼠模型的有效性。

1.5 BMSCs培养

取骨髓2.5 mL，置于抗凝管中。将骨髓与等体积的含1 %双抗的培养液混合。离心，去除上清。重悬细胞，缓慢注入Percoll液，离心，吸取中间细胞层，加培养基，吹打混匀于培养箱进行培养。每24 h换液，显微镜下观察细胞。胰酶消化后，调节细胞浓度至2×105个/mL，培养。融合度达到70 %以上，传至3代。

1.6 BMSCs鉴定

细胞离心，分装于管中，离心后弃PBS液，保留50 μL，于每管细胞样品中加的CD34、CD45、CD73、CD105以及单克隆抗体各10 μL，孵育，清洗，重悬细胞，流式细胞仪进行检测。

1.7 转染

将转染模拟物(10 μL)和对照片段(200 nmol)溶解于150 μL光学MEM-细胞培养基中制备模拟混合物。LipofectamineTM2000 (5 μL) 溶解于150 μL的Opti-MEM I(1X)还原血清培养基作为转染溶液。细胞播种在6孔板，在碱性α-MEM培养基中培养过夜。将转染溶液和模拟混合物混合，在细胞密度达到80 %混杂度时加入细胞，并孵育20 min。然后将混合物加入细胞中，在37 ℃的5 % CO2环境中孵化，加入无青霉素/链霉素的完整培养基2 mL。将实验组BMSCs分为用30 mmol/L葡萄糖处理的高糖组和用5.6 mmol/L葡萄糖处理的低糖组。将实验组细胞转染模拟物(过表达)，同法分高糖组和低糖组。

1.8 RT-qPCR实验

从BMSCs中用Trizol提取RNA。用Nano-100微量分光光度计进行定量。使用通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)进行反转录。GoTaq® qPCR Master Mix(A6002)用于检测Axin1、Runx2、miR-124-3p的水平。使用Primerpremier5设计引物(表1)。miRNA的相对表达内参为U6，其他的相对表达内参为β-action。

1.9 双重荧光素酶报告基因检测

利用http://www.targetscan.org/vert_71/网站预测，miR-124-3p可能结合的Wnt通路靶位点Axin1。构建野生型靶基因3’端非翻译区荧光素酶报告基因载体pMIR-Axin1-WT及 miR-124-3p 靶序列突变型载体pMIR-Axin1-MT。将实验组BMSCs细胞接种于24孔板，用Lipofectamine 2000将pMIR-Axin1-WT、pMIR-Axin1-MT荧光报告载体与miR-124-3p 模拟物共转染到293 T细胞中。双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。确定 miR-124-3p 靶向结合基因Axin1。

1.10 碱性磷酸酶(ALP)染色

用碱性磷酸酶染色试剂盒(Bio-Rad公司，美国)进行ALP染色。将细胞植入6孔板，用4 %对甲醛(pH 7.4)固定1～2 min，用磷酸盐缓冲盐(PBS)和三缓冲盐水(TBST)洗涤两次。加入ALP染色溶液覆盖细胞，在室温下阴凉处孵育15～20 min。丢弃ALP染料后，用PBS清洗细胞。然后在孔中添加适当量的PBS，显微镜下观察。在定量分析中，用10 %十二酰氯化吡啶去除ALP染料15 min，并测量在540 nm处的吸光度，然后计算出相对的ALP活性。

1.11 茜素红染色

将细胞种到6孔板中，4 %的多聚甲醛固定15～30 min。用PBS洗涤细胞3次，加入0.2 %茜素红染色溶液(pH 8.3)1～5 min。高葡萄糖条件转染miR-124-3p 模拟物，孵育，在显微镜下观察。然后用20 %甲醇和10 %醋酸的溶液溶解茜素红染料，并通过测量其在570 nm处的吸光度进行量化。然后计算相对茜素红染色。

1.12 统计学处理

2 结果

2.1 糖尿病模型大鼠的葡萄糖和脂质代谢

实验组TG、TC、FPG、HbA1C值上调(图1 a、b、c、d)，β-CTX和SOST上调，OC和骨密度下调(图1 e、f、g、h)。

图1 糖尿病模型大鼠的葡萄糖和脂质代谢、骨密度(*P<0.05)Fig.1 Glucose and lipid metabolism and bone mineral density in diabetic model rats (* P <0.05)

2.2 BMSCs鉴定

流式细胞术分析BMSCs(图2)：CD73和CD105的表达为阳性，CD34 和 CD45 的表达呈阴性。符合间充质干细胞的抗原特点，证实为BMSCs。

图2 流式细胞术分析BMSCs的细胞表面标记分子Fig.2 Flow cytometry analysis of BMSCs cell surface marker molecules

2.3 miR-124-3p调控BMSC成骨分化及高糖组中Axin1 RNA表达

对照组和实验组检测miR-124-3p表达，实验组明显低于对照组(图 3a)。过表达miR-124-3p(模拟物)7、14、21 d，ALP、茜素红染色随时间逐渐升高(图3b、c)。模拟物转染后7 d miR-124-3p表达水平显著升高(图3 d)。高糖组中Axin1 RNA表达水平上调，但用miR-124-3p模拟物转染时水平下降(图 3e)。

注：a：miR-124-3p在实验组、对照组表达；b、c ：ALP、茜素红染色；d：模拟物转染miR-124-3p水平；e：高糖组中Axin1 表达及模拟物转染时水平；*P<0.05。图3 miR-124-3p调控BMSCFig.3 MiR-124-3 p regulation of BMSC

2.4 荧光素酶报告基因检测miR-124-3p和Axin1靶向结合

用数据库(www.targetscan.org)分析miR-124-3p和Axin1之间的关系，结果表明，miR-124-3p和Axin1具有靶向结合位点(图4)。

荧光素酶报告基因结果显示，miR-124-3p可抑制野生型野生型(pMIR-Axin1-WT)的萤光素酶活性，而不影响突变型(pMIR-Axin1-MT)活性(图4)。

图4 Targetscan网站证明靶向结合位点，荧光素酶报告基因结果(*P<0.05)Fig.4 Targetscan site proof of targeted binding site, luciferase reporter gene results (*P<0.05)

2.5 高葡萄糖诱导对miR-124-3p表达的影响和成骨性分化

高葡萄糖摄入显著降低了miR-124-3p、Runx2表达(图5 a、b)。通过茜素红染色和ALP染色进行病理分析，发现高糖可抑制成骨分化，减少钙沉积，减少ALP表达(图5 c、d)。

图5 高葡萄糖和低葡萄糖诱导的细胞中的miR-124-3p、 Runx2及成骨的表达水平(*P<0.05)Fig.5 Expression levels of miR-124-3p, Runx2, and osteogenesis in high and low glucose induced cells (*P<0.05)

2.6 高血糖条件下miR-124-3p过表达(模拟物)对成骨分化的影响

Runx2的表达显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。茜素红染色和ALP染色显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。

图6 高血糖条件下miR-124-3p过表达对成骨分化的影响(*P<0.05)Fig.6 Effect of miR-124-3p over-expression on osteogenic differentiation under hyperglycemia (*P<0.05)

3 讨论

研究表明miRNA可以调节Wnt通路并参与成骨分化。miR-124-3p可通过调控Wnt通路促进成骨分化[9]。研究[10]发现，糖尿病性骨质疏松症患者中miRNA的差异会增加骨折的风险，miR-382-3p可以促进骨的形成。有证据[8]表明，Wnt通路及Axin1参与调节许多细胞功能，包括细胞增殖、干细胞再生、细胞凋亡、胚胎发育、代谢、分化和细胞运动。Wnt通路参与了糖尿病性骨质疏松症的骨骼形成[11]。miR-124-3p参与Wnt通路的调节，通过调节成骨干细胞形态、成骨细胞粘附和成骨细胞的转录来参与成骨分化过程[12]。在Wnt信号未被激活时，Axin1作为一个支架蛋白与Gsk-3β和 APC形成降解复合物，降解胞质中的 β-catenin，使其浓度较低。当Wnt被激活时，细胞内DVL募集，DVL拮抗降解复合物的活性可以使β-catenin质内聚积，继而发生核转位，在TCF/LEF的作用下，β-catenin引起下游靶基因转录[13]。

本研究ELISA检测血生化指标，实验组TG、TC、FPG、HbA1C值上调，β-CTX和SOST上调，OC和骨密度明显下调，验证了糖尿病骨质疏松大鼠模型建立的有效性。大鼠BMSCs培养后，流式细胞学鉴定，CD73和CD105的表达呈阳性，CD34 和 CD45 的表达呈阴性。符合间充质干细胞的抗原特点，证实为BMSCs。

实验组miR-124-3p表达明显低于对照组。过表达miR-124-3p(模拟物)7、14、21 d后，ALP、茜素红染色随时间逐渐升高。模拟物转染细胞后miR-124-3p表达水平显著升高。证明了糖尿病骨质疏松大鼠股骨miR-124-3p下调，miR-124-3p是一个成骨因子。

实验组细胞用miR-124-3p模拟物转染，结果高糖组Axin1 RNA表达水平上调，但用miR-124-3p模拟物转染时水平下降。用数据库研究miR-124-3p和Axin1具有靶向结合位点，荧光素酶报告基因结果显示miR-124-3p可显著抑制野生型pMIR-Axin1-WT的萤光素酶活性，而不影响突变型pMIR-Axin1-MT荧光报告基因活性。证实了miR-124-3p可靶向调节Axin1，两者为相反的关系。

RT-qPCR检测实验组BMSCs高糖摄入显著降低了miR-124-3p、Runx2表达；高糖可抑制成骨分化，减少钙沉积，减少ALP表达。这说明了高糖的成骨抑制性，高糖抑制miR-124-3p及成骨因子。高血糖条件下miR-124-3p过表达(模拟物)中Runx2的表达显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。茜素红染色和ALP染色显示，高糖+对照明显低于低糖+对照组；高糖+miR-124-3p模拟物明显高于高糖+对照组。这说明高葡萄糖的情况下，miR-124-3p过表达可以逆转BMSC成骨标志物Runx2。茜素红染色和ALP染色证明，miR-124-3p过表达能恢复高糖对骨发生的抑制作用，同时升高高葡萄糖诱导的钙沉积和ALP的表达。

总之，本研究证明了 miR-124-3p能通过靶向抑制Axin1促进糖尿病骨质疏松症大鼠BMSC的成骨发生。本文为临床治疗糖尿病性骨质疏松症提供了新的理论，我们可以通过调控miR-124-3p及其靶因子Axin1的水平治疗糖尿病骨质疏松症。