胃癌组织中维甲酸相关孤儿受体α、微管相关蛋白轻链3的表达与病人远期预后的关系

薛志有 倪志海 张毅

我国胃癌早期诊断率较低，病死率较高，主要是术后肿瘤复发及转移所致。了解胃癌病人病情发生、发展过程并进行有效评估，对提高病人生命质量具有重要意义[1-2]。维甲酸相关孤儿受体α(retinoid acid receptor related orphan receptorα，RORα)在人体脂肪、骨骼肌和大脑组织中广泛表达，可与孤儿核受体(REV-ERBα)作用发挥调节糖代谢、炎症反应、癌症等相关活动[3-4]。微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAPLC3)是自噬体特异性标志蛋白，在肿瘤细胞自噬过程中发挥重要作用[5-6]。本研究以82例胃癌病人为研究对象，检测其胃癌组织中RORα、MAPLC3表达，探讨其表达与胃癌病人远期预后的关系。

对象与方法

一、对象

我院2018年1月～2018年6月收治的胃癌病人82例，男性54例，女性28例；年龄31～82岁，平均年龄(60.32±3.14)岁。根据病人3年生存情况将病人分为死亡组(32例)和存活组(50例)。纳入标准：(1)诊断符合美国肿瘤联合会及抗癌联盟胃癌诊断及分期系统标准[7-8]，年龄>18岁；(2)临床资料完整；(3)术前未进行放化疗或靶向治疗；(4)病人或家属知情且签署知情同意书。排除标准：合其他恶性肿瘤者；合并严重心、肝、肾功能障碍或疾病；合并全身性感染；认知障碍或精神疾病；其他原因导致的死亡。本研究获得我院伦理委员会批准。

二、方法

1.取病人癌组织和癌旁组织标本制作成4 μm厚石蜡切片，采用免疫组织化学染色法检测组织中RORα表达MAPLC3。室温封闭内源性过氧化物酶10分钟，加入一抗室温孵育2小时，滴加二抗，DAB显色，苏木精复染，自来水清洗3分钟吹干。每张切片随机取5个视野在200倍显微镜下进行阅片，棕黄色颗粒为阳性。组织中RORα免疫组织化学染色结果强度评分进行最终结果判定。细胞内染色强度评分标准为，无染色为0分，染色强度≤25%为1分，染色强度5%～25%为2分，染色强度≥50为3分，0～2分为阴性，3分为阳性。组织中MAPLC3免疫组织化学染色结果以每张切片着色程度与着色细胞百分率乘积作为最终评分结果。细胞内染色强度评分标准为，无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分；无阳性细胞为0分，阳性细胞所占比例≤10%为1分，阳性细胞所占比例10%～50%为2分，阳性细胞所占比例50%～75%为3分，阳性细胞所占比例75%以上为4分。以每张切片着色程度与着色细胞百分率乘积作为最终评分结果，癌组织评分≤3分为阴性表达，≥3分为阳性表达。

2.随访：记录3年病人生存情况，每周进行1次电话联系，每月进行1次门诊复诊邀约。截止2021年6月31日。

3.观察指标：(1)不同组织中RORα、MAPLC3表达水平比较;(2)胃癌组织中RORα、MAPLC3阳性表达在各项临床病理因素中分布;(3)比较两组不同预后病人性别、年龄、肿瘤大小、癌细胞类型、病理分级、T分期、分化程度、淋巴结转移等因素情况及胃癌组织中RORα、MAPLC3表达，确定与胃癌病人远期预后相关因素;(4)对T分期、分化程度、淋巴结转移、RORα、MAPLC3表达等胃癌预后相关单因素进行COX多因素回归分析，筛选出独立危险因素。

三、统计学处理

采用SPSS19.0软件对数据进行分析，计数资料用例(%)表示，采用χ2检验，多因素分析采用COX回归分析，预后关系分析采用ROC曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.不同组织中RORα、MAPLC3表达水平比较：癌组织中RORα阳性表达率为42.68%，MAPLC3阳性表达率为43.90%，癌旁组织分别为84.15%、91.46%，两种组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同组织中RORα、MAPLC3表达水平比较(例，%)

2.胃癌组织RORα、MAPLC3表达与临床病理因素的关系：胃癌组织中RORα、MAPLC3表达与病人性别、年龄、肿瘤大小、癌细胞类型、病理分级差异无统计学意义(P>0.05)；RORα表达与T分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，MAPLC3表达与T分期、分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)，见表2。3年随访期内，82例病人中50例存活，32例死亡。

表2 胃癌组织RORα、MAPLC3表达与临床病理因素的关系(例，%)

3.胃癌病人远期预后单因素分析见表3。结果表明，T分期、分化程度、淋巴结转移、RORα表达、MAPLC3表达与胃癌病人远期预后相关(P<0.05)。

表3 胃癌病人远期预后单因素分析(例，%)

4.胃癌病人远期预后多因素分析见表4。结果显示，T分期(OR=1.779，95%CI：1.109～5.656)、分化程度(OR=1.621，95%CI：1.029～2.554)、淋巴结转移(OR=1.876，1.020～3.451)、RORα(OR=2.815，95%CI：1.401～5.656)、MAPLC3(OR=3.080，95%CI：1.305～7.268)是胃癌病人远期预后的独立危险因素(P<0.05)。

表4 胃癌病人远期预后多因素COX回归分析

5.胃癌组织中RORα、MAPLC3与胃癌远期预后的ROC曲线：胃癌组织中RORα阳性表达在评估胃癌病人预后生存的曲线下面积为0.67(95%CI：1.024～3.216)，敏感性为72.34%，特异度为64.58%；胃癌组织中MAPLC3阳性表达在评估胃癌病人预后生存的曲线下面积为0.65(95%CI：1.023～2.547)，敏感性为74.52%，特异度为65.13%。见图1。

图1 胃癌组织中RORα、MAPLC3与胃癌远期预后的ROC曲线

讨论

胃癌发病率和死亡率呈增加趋势，外科手术是根治性治疗的主要方式，但术后复发和转移是影响病人预后的重要原因[9-10]。胃组织恶性病变过程多细胞因子异常表达和信号转导参与其中，靶基因自噬在胃癌发生发展过程中扮演重要角色。MAPLC3是自噬相关基因同源物，RORα可调节基因相关活动，参与疾病发生发展过程[11-12]。本研究发现，胃癌病人组织中RORα、MAPLC3表达下降，RORα、MAPLC3低表达是胃癌病人远期预后的独立影响因素。

本研究结果显示，胃癌组织中RORα、MAPLC3表达低于癌旁组织，说明RORα、MAPLC3在胃癌组织中表达下降，RORα、MAPLC3异常表达可能参与恶性肿瘤的发生或发展。有研究表明，RORα可通过与REV-ERBα结合影响白细胞介素-6、炎症因子、蛋白酶抑制剂、糖脂代谢指标等蛋白因子表达，促进免疫疾病、心血管疾病的发病过程，RORα表达下降，导致凋亡蛋白激活，进而诱导凋亡因子表达，导致细胞凋亡。MAPLC3是自噬同源物，MAPLC3表达下降，自噬体减少，细胞自噬水平降低，自噬抑制肿瘤生长能力降低，肿瘤细胞活化，进而参与胃癌肿瘤生长分化过程[13-14]。癌组织中RORα、MAPLC3表达缺失与胃癌发生发展密切相关。RORα阳性表达与T分期、淋巴结转移有关，MAPLC3阳性表达与T分期、分化程度、淋巴结转移有关。单因素和多因素分析结果显示，T分期、分化程度、淋巴结转移、RORα、MAPLC3表达是胃癌病人远期的影响因素，说明随着T分期、分化程度的升高和淋巴结转移的发生，及RORα、MAPLC3表达较低病人，胃癌恶性程度升高，预后较差。RORα可通过特异性基因调节参与基因表达调控，通过与辅激活因子或辅抑制因子结发挥基因转录作用，进而改变靶基因构象。恶性肿瘤与癌基因和抑癌基因表达相关，细胞恶性增殖是恶性肿瘤发病的重要前提，RORα可通过与REV-ERBα结合调控BMAL1和COLCK基因表达，进而激活p73凋亡蛋白，导致Caspase-3、Bax、Bcl-2等相关凋亡因子表达，细胞凋亡加剧[15-16]。有研究表明，RORs可通过调节Th17细胞表达参与多种免疫性疾病发生，对肝癌发病具有重要意义，RORα可诱导基因表达而影响癌细胞的侵袭能力[17-18]。因此，RORα低表达影响胃癌的发展及预后。MAPLC3位于前自噬泡和自噬泡表面，可反映自噬体数量，是自噬体特异性标志蛋白，参与自噬调控，MAPLC3活化时可促进自噬体形成。MAPLC3表达缺失，自噬体减少会导致氧化应激，增加瘤性突变，导致肿瘤细胞增殖、分化及侵袭转移[19-20]。因此，MAPLC3表达缺失与胃癌发生、发展及预后相关。

另外，ROC曲线结果显示，胃癌组织RORα表达评估胃癌病人预后生存的曲线下面积为0.67，敏感性为72.34%，特异度为64.58%；胃癌组织MAPLC3表达在评估胃癌病人预后生存的曲线下面积为的曲线下面积为0.65，敏感性为74.52%，特异度为65.13%，说明胃癌组织中RORα、MAPLC3表达对胃癌病人远期预后具有较好评估作用。因为RORα可与靶基因上相关蛋白结合，抑制Wnt信号通路，参与细胞增殖和肿瘤进展调控。RORα表达下降，细胞增殖增加，促进胃癌发生发展[21-22]。自噬可对受损细胞进行清除，保持细胞内环境稳定。MAPLC3在前自噬泡以及自噬泡膜表面显著表达，因此，MAPLC3表达可反映自噬状态，进而为肿瘤增殖、生长评估提供参考。因此，RORα、MAPLC3低表达病人癌细胞侵袭力高，恶性程度高，且易发生转移，病人预后较差需及时调整治疗方案[23-24]。由于本次样本量较少，且基因表达的多样性生物学作用较复杂，还需扩大样本，充分了解其分子机制。

综上所述，胃癌组织中RORα、MAPLC3低表达是胃癌病人远期预后的独立危险因素，RORα、MAPLC3表达缺失是胃癌病人复发转移的影响因素，检测胃癌组织中RORα、MAPLC3表达，可为胃癌病人病情程度及预后评估提供参考。