蓝莓花色苷抑菌活性及其在复合果蔬肉制品中的应用

路高勇，马 剑，陈智玲，边道刚，马艳弘

（1. 丰县综合检验检测中心，江苏 徐州 221700；2. 江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；3. 徐州双信食品有限公司，江苏 徐州 221700）

即食果蔬肉制品是在传统即食肉制品基础上，加入水果、蔬菜、大豆蛋白和调味料等辅料煮制而成的熟食复合肉制品。因其营养全面、风味独特、方便快捷等优点备受市场青睐[1]。随着人们对食品安全与营养健康认知的提高，复合果蔬肉制品的绿色制造及其品质提升技术已经成为肉制品加工领域的研究热点。但是，复合果蔬肉制品的货架期短，在生产和销售过程中极易被微生物污染而成为人类食源性疾病的载体[2-3]。因此，复合果蔬肉制品的贮藏保鲜技术是复合肉制品工业化生产中亟待解决的技术问题。

蓝莓是21 世纪功能性保健浆果，被联合国粮农组织（FAO） 列为人类五大健康食品之一[4]，具有极高的经济价值和开发前景。蓝莓含有多种活性物质，如花色苷、黄酮醇、酚酸等[5]，具有免疫调节、保护视力[6]、抗炎抗肿瘤、抗氧化[7]、抗衰老[8]、保护心血管[9]等多种药理保健功能，在功能食品、生物医药、医疗美容等领域均具有良好的发展潜力。其中，蓝莓花色苷作为一种天然色素，被认为是最有效的天然自由基清除剂[10]。有研究表明，蓝莓花色苷对枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等致病菌具有一定的抑制作用[11]。但迄今为止，蓝莓花色苷在肉制品防腐保鲜方面的研究报道较为少见。因此，以蓝莓渣为原料提取花色苷，通过研究其抑菌作用及其对复合果蔬肉制品的保鲜效果，旨在为天然植物保鲜剂的开发和蓝莓渣的高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓渣，句容万山红遍生物科技有限公司提供；供试菌株：大肠埃希氏菌、单增李斯特菌、沙门氏菌，江苏省农业科学院农产品加工研究所提供；鲜猪肉、山药、苹果及调味料，购自苏果超市；鸡蛋皮、红薯泥、苹果汁、大豆蛋白，徐州双信食品有限公司提供；BCA 蛋白测试盒，丙二醛（MDA） 试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、琼脂，国药集团化学试剂有限公司提供；其他试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

HPP600 MPa 型超高压食品处理装置，包头科发高压科技有限责任公司产品；RE-5220 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；HJ-6A 型多头磁力搅拌器，常州国华仪器有限公司产品；ZD-F12 型真空冷冻干燥机，南京载智自动化设备有限公司产品；LRH-150 型生化培养箱，上海一恒科技有限公司产品；HH-2 型恒温水浴锅，金坛市恒丰仪器厂产品；Epoch 型全自动酶标仪，BioTek 公司产品；D-B5 型紫外可见分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司产品；SW-CJ-1D 型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司产品；3K15 台式冷冻离心机，德国Sigma 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓花色苷的制备

参照李鹏等人[12]研究方法稍做修改，取蓝莓渣干粉按1∶20（g∶mL） 的料液比加入60%乙醇溶液（V/V，pH 值3.0），转入聚乙烯袋，封口后置于超高压设备中于400 MPa 压力下保压9 min，然后离心，上清液通过旋转蒸发仪浓缩，再用AB-8 型大孔树脂纯化，50%乙醇溶液洗脱2 次，合并洗脱液，旋转蒸发仪浓缩，真空冷冻干燥至恒质量得蓝莓花色苷，于-20 ℃下冷冻保藏备用。

1.3.2 蓝莓花色苷体外抑菌活性

（1） 菌种活化及菌悬液的制备。取出保存的大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌菌悬液于常温下解冻，取100 μL 大肠杆菌和沙门氏菌菌悬液加入到100 mL LB 液体培养基中，100 μL 单增李斯特菌菌悬液加入到100 mL BHI 液体培养基中，均在温度37 ℃，转速 120 r/min 摇床培养 18～24 h，活化 2 次后置于4 ℃冰箱中待用。在超净台中，用无菌生理盐水稀释活化好的菌种，制备浓度为106～108CFU/mL的菌悬液，备用。

（2） 抑菌活性的测定。参照李晓娇等人[13]研究方法稍做修改。分别配置质量浓度为0，2.5，5.0，10.0 mg/mL 的蓝莓渣花色苷溶液。将活化的供试菌种100 μL 接种到100 mL 固体培养基中，摇匀，倒平板，待完全凝固后，用灭过菌的打孔器打出4 个直径约为10 mm 的孔，吸取200 μL 花色苷溶液加入到孔中，无菌生理盐水作为空白对照，放置于37 ℃生化培养箱中培养24 h。观察是否出现抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈的直径大小，并作记录。

（3） 最小抑菌（MIC） 浓度的测定。采用二倍稀释法[14]，分别配制30 mL 终质量浓度为10.000，5.000，2.500，1.250，0.625，0.313 mg/mL 蓝莓渣花色苷培养基，无菌水作为空白对照。将培养基倒入平皿中，待冷却凝固后，将50 μL 菌悬液加入平皿中并涂布均匀。将供试菌置于培养箱中37℃下培养24 h，观察有无可见菌落并计数。

1.3.3 果蔬重组肉制品的制备

（1） 工艺流程。原料肉混合→绞碎→混合拌料（加红薯泥、苹果汁、香菇丁、大豆蛋白、香辛料）→腌制→成型→蒸煮→冷却→蓝莓花色苷溶液浸渍→真空包装→冷藏。

（2） 操作要点。①原料肉去除筋膜，将2 份前腿肉，1 份五花肉混合绞碎，再加0.5 份红薯泥和0.6 份苹果汁，0.1 份香菇丁，0.05 份大豆蛋白、香辛料充分混匀，腌制40 min，装入模具压制成型，蒸煮熟化20 min，冷却后放入蓝莓花色苷溶液中浸渍1 min（溶液中花色苷添加量占复合肉制品的质量浓度分别为0.5，1.0，2.0，4.0 mg/g），沥去水分，真空包装，于4 ℃下冷藏备用。②添加的香辛料（占复合肉制品的质量百分比）：食盐1.5%，桂皮0.1%，八角0.1%，花椒0.15%，生姜0.35%，大葱0.5%，酱油0.2%，白酒1%。

1.3.4 感官评价

将制备好的复合肉制品切片，选择10 名受过专业训练成员组成的感官评价小组，在标准品尝室进行感官评价。

产品感官质量评分标准见表1。

表1 产品感官质量评分标准

1.3.5 花色苷对复合果蔬肉制品的防腐保鲜效果分析

以未用花色苷处理的样品作对照，每隔2 d 取样测定复合果蔬肉制品的TVB-N（挥发性氨基氮）、脂质氧化（丙二醛） 值、细菌总数等指标。

菌落总数的测定：根据GB 4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》[15]，采用倾注平皿计数法测定样品菌落总数变化。评价标准：熟肉制品中微生物安全限量标准为5 lgCFU/g[16]。

挥发性盐基氮（TVB-N） 值的测定：根据GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[17]。即取5 g 均质样品，加入25.0 mL三氯乙酸溶液振摇1 min，静置15 min 待蛋白沉淀后过滤，采用凯氏定氮仪进行蒸馏，5 mL 硼酸加2 滴指示剂用于接收蒸馏液，最后以盐酸标准滴定溶液（0.010 mol/L） 滴定至终点。

脂质氧化（丙二醛） 值的测定：采用硫代巴比妥酸法测定脂质氧化程度[18]。结果以丙二醛（MDA）表示。准确称取样品2.0 g，加入8 mL 生理盐水，冰水浴条件下超声破碎2 min 制成样品悬液，检测MDA 含量。具体按照细胞丙二醛（MDA） 测试试剂盒说明书进行测定。

1.4 数据处理

所有试验均重复3 次，结果取平均值。采用Origin 8.5.0 进行绘图和数据分析。

2 结果与分析

2.1 蓝莓花色苷的抑菌能力分析

2.1.1 蓝莓渣花色苷的抑菌能力

蓝莓渣花色苷的抑菌效果见图1，蓝莓渣花色苷的抑菌能力见表2。

图1 蓝莓渣花色苷的抑菌效果

由图1 和表2 可知，与对照组相比，加入蓝莓渣花色苷的小孔均出现明显的抑菌圈，表明蓝莓渣花色苷对3 种供试菌均具有抑菌效果[11]，且抑菌圈直径随着蓝莓渣花色苷质量浓度的增加而增大。蓝莓渣花色苷对3 种致病菌的抑菌作用强弱的依次为沙门氏菌＞大肠杆菌＞单增李斯特菌。当花色苷质量浓度为10 mg/mL 时，沙门氏菌出现的抑菌圈最大，直径达到20.07±1.10 mm，而大肠杆菌和单增李斯特菌的抑菌圈直径分别为19.93±1.90，17.47±1.50 mm。说明，蓝莓花色苷中的锦葵色素和矢车菊素对3 种食品中常见的致病菌有着良好的抑制作用，通过改变菌体的细胞膜通透性达到抑菌的效果。

表2 蓝莓渣花色苷的抑菌能力

2.1.2 最小抑菌质量浓度（MIC） 的测定

蓝莓渣花色苷的最小抑菌质量浓度见表3。

表3 蓝莓渣花色苷的最小抑菌质量浓度

由表3 可知，与对照组相比，蓝莓渣花色苷对3 种致病菌的生长均具有一定的抑制作用，且抑制能力随着花色苷质量浓度的增大而增大。对于不同菌种，花色苷的抑制效果不同，对大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的最小抑菌质量浓度分别为5，10，5 mg/mL，表明蓝莓花色苷对大肠杆菌和沙门氏菌有较强的抑菌作用，而对单增李斯特菌的抑制效果相对较弱。蓝莓花色苷对于食品中常见的有害菌都存在一定的一致作用，对于蓝莓花色苷在复合果蔬肉质品种的应用提供一定的理论基础，具有广阔的开发前景。

2.2 蓝莓花色苷对复合果蔬肉制品感官评分的影响

复合果蔬肉制品感官评定结果见图2。

图2 复合果蔬肉制品感官评定结果

由图2 可知，除0.5 mg/g 花色苷处理组外，其他花色苷处理组的感官评分均显著高于对照组（p＜0.05），其中高含量2.0 mg/g 花色苷处理组的感官评分最高（93.3±3.67），但其与4.0 mg/g 花色苷处理组 （91.42±2.87） 无显著性差异 （p＞0.05），高含量的花色苷处理后，复合果蔬肉制品的色泽变得更加具有特点，口感风味更加突出，营养品质保存较好，导致其感官评分较高；1.0 mg/g 处理组感官评价略低，可能是此时花色苷含量对样品的口感影响较小，主要为色泽的改变，导致其感官得分的上升，表明一定含量的蓝莓渣花色苷能有效提高复合果蔬肉制品的色泽和风味。

2.3 蓝莓花色苷对复合果蔬肉制品脂质抗氧化程度的影响

丙二醛是评判肉类中脂肪氧化的良好指标，由动物脂质代谢转化而生成[18]。

复合果蔬肉制品冷藏过程中的MDA 值见图3。

图3 复合果蔬肉制品冷藏过程中的MDA 值

由图3 可知，各组复合肉制品的MDA 含量随贮藏期的延长而迅速增加，说明样品中均发生了脂质氧化反应。复合肉制品的各组冷藏前4 d，MDA 上升速度缓慢，4 d 之后，各组MDA 含量快速升高。且在相同冷藏时间内，花色苷浓度越大，复合肉制品中MDA 含量越低，冷藏到第10 天时，对照组MDA 含量 （6.57 nmol/mg pro）t 上升至初始值 （3.12 nmol/mg pro）t 的2 倍，说明脂质氧化是肉制品贮藏过程中最易发生的反应，也是复合果蔬肉制品品质下降的重要原因；而4.0 mg/g 花色苷处理组MDA 含量为4.87 nmol/mg prot，比对照组降低了25.88%，说明添加外源花色苷可以很好地抑制复合果蔬肉制品中脂质反应的发生，这是由于花色苷中具有很强的羟基清除能力和抗氧化能力。因此，蓝莓花色苷在防止复合果蔬肉制品脂质氧化方面作用突出，表现出极强的保鲜能力。

2.4 蓝莓花色苷对复合肉制品TVB-N 的影响

挥发性盐基氮是肉制品蛋白质在微生物或内源蛋白酶共同作用下生成的含氮降解产物，通常被作为评判肉制品新鲜程度的重要指标[19]。

复合果蔬肉制品冷藏过程中TVB-N 值见图4。

图4 复合果蔬肉制品冷藏过程中TVB-N 值

由图4 可知，2 d 之内，各组挥发性盐基氮含量相对平缓，2 d 之后，随着贮藏期的延长，各组复合果蔬肉制品的挥发性盐基氮含量均呈上升趋势，其中空白组的上升速度最快，说明其新鲜度最差[19]。同一贮藏期内，花色苷浓度越高，其复合果蔬肉质品的TVB-N 的含量越低，表明花色苷能抑制样品中微生物的产生，从而降低复合果蔬肉质品的TVB-N 值。在第6 天时，对照组的TVB-N 值达21.9 mg/100 g，已超过了国家规定的变质肉标准（20 mg/100 g）。而4 mg/g 处理组在贮藏的第10 天时其挥发性盐基氮值为17.12 mg/100 g，比对照组降低了39.58%，并低于国家标准，表明用4 mg/g 处理后的复合果蔬肉制品保留新鲜程度较长，并且具有食用价值。由此可知，添加蓝莓花色苷可有效延缓复合果蔬肉制品的腐败程度，降低TVB-N 值的含量，从而延长保藏时间，达到保鲜目的。

2.5 蓝莓花色苷对贮藏期复合肉制品菌落总数的影响

微生物是导致肉制品腐败的重要因素，降低微生物含量是延长肉制品贮藏期的重要技术手段。

复合肉制品冷藏过程中菌落总数的变化见表4。

表4 复合肉制品冷藏过程中菌落总数的变化

由表4 可知，随着冷藏时间的延长，各组复合肉制品中菌落总数都有所增加。同一时间内，花色苷处理组菌落总数低于对照组，高含量花色苷处理组菌落总数少于低含量花色苷处理组。贮藏到第8 天时，对照组与0.5 mg/g 处理组的菌落总数均超过国家标准最低要求，而其他花色苷处理组的菌落总数均低于国家标准最低要求。其中4.0 mg/g 花色苷处理组在贮藏10 d 时仍具有食用价值，其菌落总数为4.732±0.059 lg（CFU/g），显著低于其他处理组（p＜0.05）。其中，比对照组的菌落总数降低了31.33%，表明较高含量的蓝莓渣花色苷能抑制细菌的增殖，对复合肉制品具有一定的防腐保鲜作用。

3 结论

蓝莓花色苷色泽诱人、食用安全性高，且具有较高的抗氧化活性和抑菌能力，在食品、药品和化妆品等领域具有较高的应用价值和市场开发潜力。研究考查了蓝莓花色苷对大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的抑菌效果。结果表明，蓝莓花色苷对3 种菌均有抑菌作用，强弱顺序为沙门氏菌＞大肠杆菌＞单增李斯特菌，当花色苷质量浓度为10 mg/mL 时，直径分别达到 20.07±1.10，19.93±1.90，17.47±1.50 mm，最小抑菌质量浓度（MIC） 分别为5，5，10 mg/mL。进一步将蓝莓花色苷应用于果蔬复合肉制品的保鲜，探讨其对产品冷藏过程中品质变化的影响。结果表明，2.0～4.0 mg/g 花色苷处理的复合果蔬肉制品色泽红润、香气浓郁、口感细腻有嚼劲，感官评分较高。蓝莓花色苷能有效降低复合肉制品的脂肪和蛋白质氧化程度，抑制细菌生长。当贮藏10 d 时，与对照组相比，4.0 mg/g 花色苷处理组的MDA 含量 （4.87 nmol/mg pro）t 降低了25.88%，挥发性盐基氮值降低了39.58%，菌落总数降低了31.33%，仍具有食用价值。说明蓝莓花色苷不仅能有效改善复合果蔬肉制品的色泽和风味，还能显著抑制细菌的增殖并有效延缓复合果蔬肉制品的腐败程度，从而延长保藏时间，且其防腐保鲜效果随着花色苷浓度的增加而提升。