LncRNA MEG3减轻缺血再灌注损伤所致肠黏膜屏障功能损害的机制*

黄贤伟，陈 波 ，蔺际龑△

(厦门大学附属第一医院：1.急诊科；2.检验科，福建 厦门 361000)

心脏骤停是致死率高的临床常见危重症[1]。缺血再灌注损伤(I/R)是心肺复苏后患者突出的表现，目前研究已证实，心肺复苏后患者存活率低下与多器官I/R密切相关[2]。其中肠黏膜I/R是影响整个病情发展的关键因素之一[3]。有效防治肠黏膜I/R是亟待解决的临床问题。心脏骤停引起肠道的缺血缺氧，导致肠道黏膜屏障遭到破坏，肠黏膜通透性增强及功能丧失，免疫功能抑制、肠道菌群紊乱等病理改变，自主循环恢复后出现肠黏膜再灌注损伤，肠道中的微生物和内毒素可通过受损的肠黏膜屏障迅速进入体循环，引起网状内皮系统发生系列反应，导致大量相关介质及细胞因子的激活与释放，神经、体液、免疫系统、内分泌系统及血管活性物质等发生剧烈变化[4]，进而导致多器官功能障碍综合征的发生，故肠黏膜I/R可成为机体“二次打击的起源”，导致复苏后患者病情恶化，甚至死亡[5]。当前研究表明，肠黏膜I/R与氧自由基损伤、钙离子超载、炎性细胞因子大量浸润、细胞大片凋亡、细胞因子释放等密切相关,但具体发病机制目前仍不是很清楚。

长链非编码RNA(LncRNA)已被发现在多种生理和病理过程中发挥着重要作用[6]。有研究表明，LncRNA uc.173通过调节微小RNA-29b/claudin-1(CLDN1)信号调节肠道屏障功能[7]。有研究通过基因芯片检测发现，肝脏I/R后LncRNA_AK139328表达上调，沉默LncRNA_AK139328表达可降低肝脏巨噬细胞水平和半胱氨酸蛋白酶-3活化水平，同时还降低了核因子κB活性，从而降低了炎性细胞因子的表达，对肝I/R产生保护作用[8]。LncRNA MEG3是一种广为人知的LncRNA，在多种病理过程中发挥着不同的作用，包括癌症进展和炎性反应[9-10]。在脑I/R的小鼠模型中已证实，LncRNA MEG3与神经功能障碍相关[11]。但LncRNA MEG3对肠黏膜I/R和肠黏膜屏障的影响尚鲜见相关文献报道。本研究探讨了LncRNA MEG3保护肠黏膜I/R后肠屏障功能的机制，旨在为肠黏膜I/R的治疗提供潜在策略。

1 材料与方法

1.1实验材料与仪器 人结直肠腺癌Caco-2细胞由美国纽约美国典型组织培养集合库提供。10%胎牛血清购自美国Gibco公司，ADV4、ADV4MEG3、ADV1、ADV1MEG3、短发夹RNA(shRNA)载体均由中国南京Genscript公司合成。Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自Keygen Biot Solasodine公司。TRIzol购自美国Invitgen公司，第一链cDNA的合成按制造商(Invitgen，美国)说明书进行。定量逆转录聚合酶链式反应(PCR)采用SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ试剂盒(Takara，日本)，使用的引物序列：MEG3正向：5′-GTGAAGGTCGGAGTGAACG-3′，反向:5′- CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′；U6正向:5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′，反向:5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′；GAPDH正向:5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′，反向:5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′。Millicell ERS-2电阻系统购自美国默克-米利波尔公司。紧密连接蛋白(Occludin)和CLDN1、次级抗体购自中国Proteintech公司。日本尼康显微镜分析免疫荧光。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将细胞培养于含10%胎牛血清、链霉素0.1 mg/mL、青霉素100 U/mL的培养基中(37 ℃、5%二氧化碳)。建立体外缺氧缺糖(OGD)模型,Caco-2细胞在5%二氧化碳、1%氧和94%氮中孵育12 h，然后将细胞在常氧条件下培养6 h以实现复氧建立OGD模型。根据腺病毒载体装载及其接受处理的不同，分为对照组、OGD组、OGD+ADV4组、OGD+MEG3组、OGD+ADV1组和OGD+shMEG3组。

1.2.2细胞存活率 采用CKK-8法检测Caco-2细胞存活率。将约5×105个Caco-2细胞置于96孔板中培养12 h，然后加入含CKK-8培养基，继续培养4 h，采用酶联免疫吸附试验微板阅读器在450 nm处分析吸光度(OD)。

1.2.3细胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒。收集大约1×106个细胞并用结合缓冲液洗涤。然后用FITC标记的Annexin V和PI在25 ℃时对细胞进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4LncRNA MEG3表达 提取总RNA。第一链cDNA的合成按制造商说明书进行。定量逆转录PCR采用SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ试剂盒。

1.2.5肠屏障功能 测定肠组织跨皮细胞电阻(TEER)值分析肠屏障功能。TEER值检测是评估肠黏膜屏障功能的重要指标[12-13]。将2×105个/mL Caco-2细胞覆盖在胶原包裹的聚碳酸酯可穿透支持补充剂上。培养基每2天更换1次。使用Millicell ERS-2在3周时用TEER测量肠屏障。用4%多聚甲醛固定Caco-2细胞30 min，用Triton×100(0.2%)处理10 min，再用牛血清蛋白处理30 min。将载玻片与Occludin和CLDN1的抗体在4 ℃下孵育过夜，然后与次级抗体在37 ℃孵育1 h。在25 ℃下用Hoechst染色10 min。用尼康显微镜分析免疫荧光。

2 结 果

2.1各组细胞LncRNA MEG3表达水平比较 OGD组、OGD+ADV4组、OGD+MEG3组、OGD+ADV1组、OGD+shMEG3组LncRNA MEG3表达水平与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；OGD+MEG3组LncRNA MEG3表达水平高于OGD组、OGD+ADV4组、OGD+ADV1组及OGD+shMEG3组，OGD+shMEG3组LncRNA MEG3表达低于OGD组、OGD+ADV4组、OGD+ADV1组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图1。

与对照组比较，aP<0.01；与OGD+MEG3组比较，bP<0.01；与OGD+shMEG3组比较，cP<0.01。

2.2各组Caco-2细胞的细胞存活率比较 OGD组、OGD+ADV4组、OGD+ADV1组、OGD+shMEG3组Caco-2细胞的细胞存活率低于对照组，而OGD+MEG3组细胞存活率高于OGD+ADV4组与OGD组，OGD+shMEG3组细胞存活率低于OGD+ADV1组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图2。

A.CKK-8法检测细胞存活率图(200×)；B.各组细胞存活率比较情况，与对照组比较，aP<0.01；与OGD+MEG3组比较，bP<0.01；与OGD+shMEG3组比较，cP<0.01。

2.3各组细胞凋亡情况比较 OGD组、OGD+ADV4组、OGD+MEG3组、OGD+ADV1组、OGD+shMEG3组细胞凋亡高于对照组，OGD+MEG3组细胞凋亡低于OGD组、OGD+ADV4组、OGD+ADV1组及OGD+shMEG3组，OGD+shMEG3组细胞凋亡高于OGD组、OGD+ADV4组及OGD+ADV1组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图3。

A.流式细胞仪检测细胞凋亡图；B.各组细胞凋亡比较情况，与对照组比较，aP<0.01；与OGD+MEG3组比较，bP<0.01；与OGD+shMEG3组比较，cP<0.01。

2.4各组Caco-2细胞TEER值比较 OGD组、OGD+ADV4组、OGD+MEG3组、OGD+ADV1组、OGD+shMEG3组Caco-2细胞的TEER值低于对照组，OGD+MEG3组TEER值高于OGD+ADV4组，OGD+shMEG3组TEER值低于OGD+ADV1组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图4A；作为对照的单层Caco-2细胞TEER值变化差异无统计学意义(P>0.05)，见图4B。

A.各组Caco-2细胞TEER值比较情况，与对照组比较，aP<0.01；与OGD+MEG3组比较，bP<0.01；与OGD+shMEG3组比较，cP<0.01；B.对照的单层Caco-2细胞TEER值。

2.5各组Caco-2细胞中紧密连接蛋白CLDN1和Occludin表达水平比较 免疫荧光显示，OGD组、OGD+ADV4组、OGD+ADV1组、OGD+shMEG3组Caco-2细胞中CLDN1和Occludin的表达水平低于对照组；OGD+MEG3组过表达LncRNA MEG3可以减轻这种作用，但OGD+shMEG3组抑制LncRNA MEG3表达则增强这种作用。见图5。

A.免疫荧光分析法检测CLDN1表达水平(200×)；B.免疫荧光分析法检测Occludin表达水平(200×)。

3 讨 论

肠黏膜I/R是心肺复苏患者救治的“瓶颈”之一，肠黏膜I/R可通过多种病理机制导致肠屏障功能障碍[14]，缺血损伤后肠道黏膜屏障遭到破坏，肠黏膜通透性增强及功能丧失，免疫功能抑制、肠道菌群紊乱等病理改变，自主循环恢复后出现肠黏膜再灌注损伤，肠道中的微生物和内毒素可通过受损的肠黏膜屏障迅速进入体循环造成患者病情恶化，当前缺乏有效治疗手段。据文献报道，核受体相关因子1通过抑制p21[15]促进I/R后肠道功能的恢复。LncRNA H19在肠黏膜I/R诱导的肠屏障功能障碍中具有保护作用[16]。LncRNA NEAT1可通过调节肠道屏障和外泌体介导的巨噬细胞极化抑制炎症性肠病中的炎性反应[17]。LncRNA SPRY4-IT1通过调控连接蛋白[18]的表达调控肠黏膜屏障能力。

OGD模型是国内外研究I/R广泛采用的离体模型[19]，LU等[20]在实验中将Caco-2细胞经OGD处理模拟肠黏膜I/R。本研究预实验发现将Caco-2细胞在5%二氧化碳、1%氧和94%氮中孵育12 h，然后将细胞在常氧条件下培养6 h实现复氧建立OGD模型，空白对照组与OGD处理后LncRNA MEG3表达调控各组比较，细胞存活及凋亡差异最显著。有研究表明，肠黏膜I/R中细胞凋亡是其黏膜细胞主要死亡机制，本研究发现，LncRNA MEG3能减少OGD诱导的Caco-2细胞凋亡增加其存活率，因此考虑LncRNA MEG3可能通过减少细胞凋亡、维持肠黏膜的完整性，从而减轻损伤。

TEER值是反映肠黏膜屏障功能的可靠指标[21]。本研究结果显示，OGD处理后Caco-2细胞TEER值显著降低，LncRNA MEG3过表达明显减轻OGD处理的Caco-2细胞TEER水平，进一步证明LncRNA MEG3能保护肠黏膜屏障功能。有研究已发现，Occludin和CLDN1是维持肠道屏障功能方面具有关键作用的蛋白[22]。本研究发现，OGD处理的Caco-2细胞中Occludin、CLDN1表达水平均明显降低；而增加LncRNA MEG3表达后上述蛋白随之升高，表明LncRNA MEG3在细胞实验中能通过减少OGD处理的肠黏膜细胞凋亡增加维护肠黏膜的完整性，并通过增加Occludin、CLDN1表达维持肠道屏障功能，从而减轻I/R后肠黏膜屏障功能障碍。

综上所述，LncRNA MEG3可能通过减少细胞凋亡并增加Occludin、CLDN1蛋白表达减轻I/R所致肠黏膜屏障损伤，保护肠黏膜的屏障功能，本研究这一发现能为肠黏膜I/R的治疗提供潜在的新策略，但LncRNA MEG3能否在活体动物及人体内发挥同样作用尚需进一步研究。