一例猪副猪嗜血杆菌病的诊断

吴 芳 福建省漳州市龙海区隆教畜牧兽医站 福建 漳州 363100

副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病或革拉泽氏病，是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）引起。该病临床上以体温升高、四肢肿胀、呼吸困难、纤维素性多发性炎症和高病死率为特征[1]。HPS是一种非溶血性、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖型、兼性厌氧、无芽孢的革兰氏阴性短小杆菌[2]。HPS只感染猪，临床上2周～4月龄猪均可感染，发病率可达40%，病死率可达50%[3]。现将一例副猪嗜血杆菌病的诊断情况报道如下。

1 发病情况

2019年3月，连续阴雨，气温骤降。福建省某养殖场的12栋保育舍（每栋饲养600头断乳仔猪），饲养员关闭卷帘对猪群进行保温，使得保育舍白天夜晚均处于密闭状态。室内温度高于室外温度，空气不流通并且潮湿。3周龄～2月龄保育仔猪表现为饮食欲不振、精神沉郁、耳朵发紫、行走缓慢、不愿站立，较为严重的患猪关节肿胀、跛行。

2 临床症状

发病初期，仔猪表现为短促咳嗽，体温达40.5～42℃，精神沉郁，食欲不振，畏寒挤卧。中期，仔猪喘气加剧，呼吸急促，眼睑水肿，鼻孔流脓性分泌物；患猪后肢关节肿胀，行走困难，无法站立，呈“犬”坐姿，甚至瘫痪；患猪扎堆而睡；部分患猪皮肤潮红，耳尖发绀。后期，患猪表现为饮食欲废绝，逐渐消瘦；皮肤苍白，被毛粗乱；呼吸困难，四肢肿胀，共济失调，最终死亡。

3 剖检病变

剖检患猪，发现颌下淋巴结和腹股沟淋巴结均出血肿大；胸腔内有大量积水；心脏表面有一层绒毛样被膜覆盖；打开腹腔见大量纤维素性渗出物附着于肠黏膜和肝、脾等组织器官表面，呈淡黄色条索状；肝瘀血肿大；肺脏肿胀并瘀血，触之有实变；胃溃疡；脑膜充血水肿；切开关节肿胀处有胶冻样物流出。

4 实验室检查

4.1 细菌分离培养 无菌采集疑似患猪的肺脏、气管、关节积液，接种于含NAD和5%犊牛血清的TSA平板以及无NAD的TSA平板上，置37℃培养24～48 h（病原菌送至省农科院检测，已经排除有其他病原共感染）。结果在含NAD和5%犊牛血清的TSA平板中可观察到圆形、光滑湿润、无色透明的菌落；无NAD的TSA平板上没有菌落生长。

4.2 细菌培养特性及形态观察 挑取单个菌落分别划线接种5%新生犊牛血清TSA固体培养基、巧克力琼脂培养基、兔鲜血琼脂培养基、麦康凯培养基、SS培养基、普通琼脂培养基中，37℃恒温培养箱中烛缸厌氧培养24 h，观察细菌生长情况。结果分离菌在麦康凯培养基、SS培养基和普通琼脂培养基中均未见生长；在兔鲜血琼脂培养基上生长差，只有极少数菌落生长；在巧克力琼脂平板、5%新生犊牛血清TSA固体培养基中生长最好，可见大量光滑湿润、无色透明的菌落生长。

4.3 涂片染色镜检 挑取部分菌落均匀涂布于滴有生理盐水的载玻片上。固定载玻片后，革兰氏染色，镜检[4]。可观察到革兰氏阴性细小杆菌，无芽孢，个别菌株呈两极浓染的球杆状。

4.4 生化试验 细菌纯化培养后，分别接种系列生化培养基，置37℃、5% CO2恒温培养箱中培养24～48 h，结果分离株对NAD依赖性、接触酶、丙二盐、葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、枸橼糖、D-核糖、果糖、山梨醇、木糖呈现阳性；对溶血性、尿酶、硫化氢、硝酸盐、吲哚呈现阴性。

4.5 PCR鉴定 将纯化好的菌株接种到TSB培养液中培养24 h。取1 mL混合液放入1.5 mL离心管中，煮沸15 min，在20 μL反应体系中10×buffer 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL、rTaq酶0.2 μL、20 mmol/L上游引物P1和下游引物P2（参照Simone Oliveira等[5]发表的报告中的合成引物：P1（5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′）、P2（5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′））各0.5 μL、模 板2.0 μL、灭菌双蒸水13.2 μL。在灭菌EP管中依次加入以上试剂，离心混匀。经过94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min进行扩增。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果在紫外凝胶成像系统中可观察到一条约在800 bp的特异性条带，其大小与预期的扩增片段大小相符（见图1）。

图1 分离菌的PCR鉴定结果

5 小结与讨论

1）根据患猪的临床症状、病理剖检，再结合培养的分离菌株的形态观察、培养特性和生化特性，初步鉴定该分离菌为HPS。用HPS序列设计引物进行PCR扩增，结果获得一条符合该病菌的特异性条带。经过上述检查，确诊该病为副猪嗜血杆菌病。

2）HPS感染在临床上很容易与传染性胸膜肺炎、猪伪狂犬病以及猪瘟等发生共感染，导致猪群病死率高达90%[6]。此外，该病的临床症状、剖检病变与猪链球菌病极其相似。副猪嗜血杆菌病常表现关节肿痛、跛行和共济失调等，常会被误诊为猪链球菌病。然而两种疫病不同的是，HPS感染具有皮肤潮红、耳朵发绀症状，患猪的关节面有浆液，为纤维素性化脓性炎症，润滑液增多；而猪链球菌病不会出现副猪嗜血杆菌病的典型症状，大多呈化脓性关节炎，触摸为硬的实性炎症。

3）目前，副猪嗜血杆菌病经常继发于其他病毒性疾病，在实际生产中，较大一部分管理者会将重心放在治疗其他病毒性疫病上，而忽视该病的防控与治疗，最终使得较多的猪只免疫力下降，最终死亡于此类细菌性疫病。又因为HPS有多种血清型，临床上很难针对某一血清型研发疫苗预防该病。副猪嗜血杆菌病发生主要与各种应激有关。在集约化养殖模式下，部分养殖场的养殖理念还是未能跟上科学养猪的要求，导致饲养管理上的不足，比如用过的针头、注射器随处摆放；多头患猪共用1个针头；猪群断乳转群时，为争夺领地互相打斗，伤口往往会被忽视，细菌容易从伤口进入猪只机体中，引起细菌性疫病；此外猪舍消毒不完全，清洗后未晾干，饲料潮湿等应激因素，也增加猪群患该病的几率。

4）大量临床资料表明，完善病毒性疫病的免疫防控和合理应用药物防治可明显降低该病的发病率和病死率。防控措施主要有以下几个方面：（1）在猪群中发现疑似该病的临床症状时，应结合相关的技术确诊，及时治疗。（2）减少应激。（3）定期消毒，彻底清理猪舍卫生。防治该病还是要做到“养防结合”，加强猪群的饲养管理，营造舒适的环境，这样既可以减少不必要的死亡与经济损失，也能使猪群健康成长。