大河乌猪STARD4基因的分子鉴定、组织表达、多态性分析与相关研究进展

李昌武，刘永刚，万长华，廖 柱

（1.海南罗牛山畜牧有限公司，海南 海口 570100；2.云南农业大学，云南 昆明 650000）

目前我国商品猪生产规模居世界首位，是世界上最大的生猪产出国，现在中国一年要生产和消费5亿头猪，占全球猪肉生产和消费量近一半。而每个中国人平均一年要消费掉近40 kg的猪肉，远远高于牛羊肉和其他所有肉类的总和。1990年城镇居民平均每人可用于生活费的货币收入为1 387元，2021年，我国城镇居民人均可支配收入47 412元，增长约35倍[1-2]。随着人民生活水平的显著提高，人们在饮食习惯上出现了明显差异和变化，从简单的对肉的需要转变成对优质、风味好、口感佳的猪肉的需求。在对猪长期选育培育的过程中，其体内脂肪含量发生一定变化，尤其是IMF（肌内脂肪）含量的变化，对肉质的风味及口感都产生一系列的影响。而目前我国一些本地猪种其IMF含量丰富，且经过杂交改良后能保持其肌内脂肪丰富的特性。王忠庆等[3]通过测定大河乌猪和大河猪肉质指标的结果表明，大河乌猪较大河猪的胴体品质和产肉性能均有较大幅度的改善，生产性能有较大幅度的提高，且有效地保持了大河猪在肉质性状上的优势，并在肉质评分上基本都优于大河猪，大河乌猪的IMF水平虽略有下降，但仍保持较高水平。此外，两品种在氨基酸和脂肪酸组成上差异不显著，也说明大河乌猪的选育过程中保持了大河猪在脂肪和蛋白质组成与结构上的优良性，大河乌猪是一种具有重要实际应用价值与研究价值的品种。因此，对其脂代谢相关功能的研究具有极为重要的意义。

STARD4（类固醇合成相关脂转移4）基因是进化上保守的START基因家族的成员，是一种可溶性的甾醇转运蛋白，与胆固醇感知和维持细胞内稳态有关。STARD4被广泛表达，并已被证明其在细胞内的脂质体和细胞器之间转移胆固醇[4]。非特异性固醇转运机制中，STARD4是在质膜和ERC（Endocyticrecycling compartment，内吞循环体）之间的固醇转运中占很大比例[5]。人类STARD4基因的结构显示其具有一个保守的α-螺旋/β-GRIP折叠，其中包含一个很深的疏水口袋，用作疏水口袋盖的Ω1-环具有封闭构象。封闭形式的甾醇结合腔的形状不能互补用来容纳胆固醇，这表明Ω1-环的构象变化对于甾醇结合是必不可少的。人类STARD4基因具有脂质体间的胆固醇转移活性，Ω1-环和疏水壁的突变使该转移活性丧失[6]。Iaea等[5]的研究表明可溶性胆固醇转运蛋白STARD4占总胆固醇转运量的25%，占质膜与内质网之间非囊性胆固醇转运量的33%。胆固醇的非囊泡转运机制，特别是STARD4，在质膜和ERC之间的甾醇转运中占有很大比例。Soccio等[7]利用cDNA微阵列，发现STARD4基因在喂食高胆固醇饮食的小鼠肝脏中的表达降低了2倍以上。Northern印迹分析（RNA印渍术）表明，内质网胁迫对STARD4的诱导仅限于早期阶段。荧光素酶报告基因分析表明，STARD4的诱导依赖于转录因子ATF6及其启动子中的类erse元件（ER stress元件，内质网压力相应元件）[8]。Garbarino等[9]也发现了STARD4表达的减少会导致胆固醇滞留在质膜上，与内质网相关的胆固醇减少，ACAT（Acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase，酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶）合成的胆固醇酯减少。Mesmin等[10]为了分析STARD4的作用机制，比较了STARD4介导的甾醇转运和简单的胆固醇载体MCD（Methyl-Beta-Cyclodextrin，甲基-β-环糊精）介导的甾醇转运。STARD4和胞内MCD的作用相似，它们增加了甾醇向ERC和ER（内质网）的转移率。其结果提示，STARD4介导的胆固醇转运是胆固醇稳态调节机制的重要组成部分。David等[4]通过敲除胆固醇转运蛋白STARD4，发现脂质体发生了很大的变化。STARD4-KD细胞的mRNA谱也有较大变化。结果表明细胞胆固醇增加，包括晚期的内小体。这些结果也表明了STARD4在脂质稳态中起着重要作用。此外，还有证据表明STARD4的表达增加还能促进胆汁酸的合成，综上所述STARD4是一种高度调控的、非囊泡性的、定向的细胞内胆固醇转运体，在维持细胞内胆固醇稳态方面发挥着关键作用[11]。

1 研究的目的与意义

关于STARD4基因的相关研究都表明其在脂肪代谢、转运或分解过程中起到一定作用，但目前在国内还很少见到关于STARD4基因与脂代谢相关功能的研究。本文对大河乌猪基因进行分子鉴定、组织表达、多态性分析，以为后续对STARD4基因在对养猪生产，构建人类疾病模型等相关研究提供基础。

2 材料与方法

2.1 试验材料与数据分析

2020年5月，随机采取云南农业大学动科院自有试验动物中心200头成年大河乌猪的肺脏组织、脂肪组织、脾脏组织、肝脏组织、肾脏组织、心脏组织、小肠组织和肌肉组织。采用GENSCAN工具对cDNA序列进行预测，利用美国国立生物技术信息中心生物大分子序列比对搜索工具对序列的同源性进行分析，利用CLUSTAL OMEGA对蛋白质进行预测和分析。对STARD4基因编码的蛋白质的等电点和分子量进行预测采用COMPUTER PI和MW TOOL工具进行。组织表达特异性分析使用Applied Biosystems 7900HT SDS来进行检测。对开放阅读框的分析使用美国国立生物技术信息中心中的开放阅读框查询软件进行。猪STARD4基因的组织表达分析采用qRT-PCR的方法进行。

2.2 试验方法

分离大河乌猪STARD4基因的全长cDNA。引物使用引物设计软件Primer Premier 5.0进行并设计5'-RACE和3'-RACE引物。STARD4基因5'-RACE和3'-RACE引物序列如表1所示。

表1 STARD4基因5'-和3'-RACE引物

RACE-PCR反应程序：94 ℃ 30 s和72 ℃ 3 min条件下进行5个循环；94 ℃ 30 s，69 ℃ 30 s和72 ℃3 min条件下进行5个循环；94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min条件下进行30个循环直至本次反应程序终止。对PCR引物扩增产物进行检测及鉴定使用凝胶电泳。

扩增反应结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测外，剩余产物用于0.8%琼脂糖凝胶电泳并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对特异性条带切胶回收。最后进行测序。

3 结果与分析

3.1 大河乌猪STARD4基因全长cDNA序列的分子克隆

经过5'-RACE和3'-RACE扩增，得到了一条长度为895 bp和一条长度为871 bp的片段，并将这些产物分别插于T-载体进行克隆测序，从而得到一个1 164 bp的全长cDNA（图1）。

3.2 大河乌猪STARD4基因的序列分析

通过BLAST比对大河乌猪STARD4基因cDNA核苷酸序列发现，该基因与已知的猪的任何基因都不同源，将该序列提交到GenBank数据库（Accession number：FJ436384）。利用GENSCAN软件对该1 164 bp cDNA序列进行基因预测，从结果中发现一个编码209个氨基酸的完全单基因该蛋白质的等电点（pI）和分子量（Mw）的计算采用Compute pI/Mw Tool软件，计算出该蛋白质的等电点为5.37，分子量为23 798.14 Da。

进一步比对分析发现该蛋白质与太平洋短吻海豚（Lagenorhynchus obliquidens）（accession number：XM_027100170）的STARD4蛋白具有91.3%的同源性、双峰驼（Camelus bactrianus）（accession number：XP_010969783）的STARD4蛋白具有96.2%的同源性、羊驼（Vicugna pacos）（accession number：XP_015094376）的STARD4蛋白具有95.2%的同源性、美洲狮（Puma concolor）（accession number：XP_025779258）的STARD4蛋白具有93.8%的同源性、虎鲸（Orcinus orca）（accession number：XP_005901130）的STARD4蛋白具有95.2%的同源性。

该蛋白具有START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_v1/CoxG/CalC（SRPBCC）ligand-binding domain superfamily结构域。

在以上STARD4蛋白质比对的结果基础上，通过EMBL-EBI（https://www.ebi.ac.uk）中的Clustal Omega工具（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）构建了STARD4基因进化树见图2。

基因进化分析表明了大河乌猪的STARD4基因与虎鲸（Orcinus orca）的STARD4基因遗传关系较近。

3.3 大河乌猪STARD4基因的基因变异分析

在猪蛋白数据库进一步比对分析发现大河乌猪STARD4蛋白还存在1个变异体Isoform X1（accession number：XP_020932818.1），与猪STARD4蛋白具有99%的高度相似性。

进一步在猪基因数据库比对分析中发现，大河乌猪STARD4蛋白质编码区存在2个突变位点（表2）。

表2 大河乌猪STARD4基因变异分析

3.4 大河乌猪STARD4基因的组织表达谱分析

组织表达谱分析表明STARD4在脂肪、肝脏、肌肉、脾脏、肾脏、小肠中高度表达，在心脏中中等表达（图3）。

4 讨论

猪在我国养殖生产中占有重要地位且其为一种重要的试验动物，而STARD4基因又与脂肪代谢和人类疾病紧密相关。目前在其他物种上，对STARD4基因的研究虽有一些报道，但对于猪STARD4基因的克隆以及对其功能的研究还鲜少报道。本试验首次克隆国内大河乌猪STARD4基因的cDNA序列全长。为后续以猪为动物模型研究STARD4基因相关疾病奠定基础。相关研究表明，STARD4能增加细胞内胆固醇酯的形成，并受细胞内固醇水平的调控。当STARD4过表达时，固醇向内吞循环体（ERC）和内质网（ER）的运输增加。STARD4介导的胆固醇转运是胆固醇稳态调节机制的重要组成部分[12]。STARD4表达的减少会导致胆固醇滞留在质膜上，与内质网相关的胆固醇减少，ACAT合成的胆固醇酯减少[10]。在后续的研究中我们将对猪STARD4基因的这些信号通路以及作用机制进行研究，寻找与STARD4基因具有相同突变基因型的个体作为模式动物，对STARD4基因与脂代谢疾病之间的关系进行进一步深入的研究。

5 结论

大河乌猪STARD4基因完整全长cDNA序列为1 164 bp，编码209个氨基酸，等电点为5.37，分子量为23 798.14 Da。猪STARD4基因编码的蛋白与太平洋短吻海豚、双峰驼、羊驼、美洲狮、虎鲸的STARD4蛋白分别具有91.3%、96.2%、95.2%、93.8%、95.2%的高度同源性。该蛋白具有START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_v1/Cox G/CalC（SRPBCC）ligand-binding domain superfamily结构域和一个变异体。其基因编码区存在2个突变位点。该基因与虎鲸的STARD4基因有着较近的亲缘关系。大河乌猪STARD4基因在肝脏、肌肉、脾脏、肾脏、小肠、脂肪和肺高度表达，在心脏中中等表达。