不同蛋白酶对豆粕中抗原蛋白的降解效果

周宇朦，孙洪浩，吕福军

（辽宁波尔莱特农牧实业有限公司，辽宁 沈阳 110122）

豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产物，因其氨基酸组成合理，适口性好，养分利用率高等特点，成为目前应用最广泛的植物性蛋白原料，约85%被用于家禽和猪的饲养[1]，需求量逐年递增。但是豆粕中存在较多的抗营养因子，如抗原蛋白、胰蛋白抑制剂、脲酶等[2]。其中抗原蛋白的危害最为严重，它会使仔猪发生过敏性腹泻、肠黏膜细胞增生，甚至造成死亡，因此抗原蛋白含量高低被视为评判豆粕品质好坏的重要指标[2-4]。抗原蛋白主要是大豆球蛋白和β-伴球蛋白，大豆球蛋白是由6个酸性亚基和6个碱性亚基构成，分子量为18～45 kD；β-伴球蛋白是由疏水作用相互缔合的α'、α和β 3个亚基单位组成，分子量为42～83 kD[1]。

应用发酵或体外酶解的方法可以提高豆粕的营养价值，从而替代或部分替代价格日益看涨的动物性蛋白[5]。体外酶解豆粕能一定程度地降低或消除豆粕中的抗原蛋白，在酶解过程中将部分大分子蛋白降解成小分子蛋白，产生大量具有特殊营养功能的小分子蛋白，提高动物对豆粕营养成分的吸收利用，缓解动物性蛋白质原料紧缺的同时提高了饲料的生物安全性[5]。

因此，本文使用8种不同酸碱性的蛋白酶对豆粕中抗原蛋白进行降解，探究不同性质的蛋白酶对抗原蛋白的影响，从而更准确地使用相应蛋白酶进行降解工作，提高工作效率。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2021年5—7月在辽宁波尔莱特农牧实业有限公司肽制剂研发中心进行。

1.2 试验材料与试剂

豆粕（市售，粗蛋白质含量43%）；8种蛋白酶，购自多个厂家，分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H，其中酶A、B、C、D是碱性蛋白酶，酶E、F、G是中性蛋白酶，酶H是酸性蛋白酶。

1.3 试验仪器

CP2102电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；GSP-9080MBE隔水式恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；101-2AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；KDN-815全自动凯氏定氮仪，山东博科生物产业有限公司；Mini-PROTEAN® Tetra System电泳仪，美国BIO-RAD。

1.4 试验方法

1.4.1 酶解豆粕方法 预先将豆粕和蒸馏水进行灭菌，根据饲料采样GB/T 14699.1—2005对无菌豆粕进行分装采样[6]。试验1：8个处理组，每组3个重复，每个呼吸袋中装入200 g豆粕、0.2%蛋白酶、100 g水，将混合物搅拌均匀，置于50 ℃培养箱中酶解40 h。酶解结束后将样品从呼吸袋中取出，置于托盘85 ℃烘干，粉碎测定抗原、小肽和粗蛋白质。试验2：5个处理组，每组3个重复，每个呼吸袋中装入200 g豆粕、0.2%碱性蛋白酶、0.2%果胶酶、100 g水，将混合物搅拌均匀，置于50 ℃培养箱中酶解40 h。酶解结束后将样品从呼吸袋中取出，置于托盘85 ℃烘干，粉碎测定抗原。空白对照组中不添加酶制剂，进行相同处理，每组做3次重复。

1.4.2 抗原蛋白的测定 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法测定[5]。

1.4.3 小肽的测定 采用QBHHS JC006—2013三氯乙酸法测定[7]。

1.4.4 粗蛋白质的测定 采用GB/T 6432—2018饲料中粗蛋白质的测定—凯氏定氮法。

1.5 数据处理

本试验数据使用 Microsoft Excel 进行记录和统计，所有试验重复3次，数据均以平均值±标准差表示。数据的单因素方差分析，应用Duncans法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶对豆粕抗原蛋白的影响

豆粕中分别添加酸碱性不同的8种蛋白酶进行酶解反应，酶解试验结束后，烘干粉碎，取样进行抗原测定。结果如图1所示，豆粕条带有些瑕疵，但从样品条带可以看出，蛋白酶可以降解豆粕中的蛋白类抗营养因子，β-伴球蛋白和大豆球蛋白减少或者完全消失。在相同的酶解参数下，各蛋白酶对豆粕中抗原蛋白的降解存在差异，酶A、B、C和G对β-伴球蛋白降解效果更明显，酶E对大豆球蛋白降解效果最差，整体看来碱性蛋白酶的降解效果最好。

豆粕中分别添加5种碱性蛋白酶和果胶酶的混合物进行酶解反应，酶解试验结束后，烘干粉碎，取样进行抗原测定。结果如图2所示，β-伴球蛋白的α、α'和β亚基几乎被完全降解，这可能是因为蛋白酶优先酶解7S组分[8]。大豆球蛋白中的酸性亚基大部分被降解，剩余碱性亚基，这是由于酸性亚基处于蛋白外部，碱性亚基位于蛋白内部[9]，蛋白酶复合果胶酶对抗原蛋白的降解效果并没有显著优于单独使用蛋白酶。

2.2 不同蛋白酶对豆粕小肽含量的影响

豆粕中分别添加酸碱性不同的蛋白酶进行酶解反应，酶解试验结束后，烘干粉碎，取样进行小肽含量测定。结果如表1所示，豆粕原料的小肽含量为8.12%，被酸碱性不同的蛋白酶酶解40 h后，小肽含量均增加，依次增加20.95、20.65、15.95、15.44、11.79、10.35、15.52和8.2个百分点。酶解后小肽含量从多到少依次是A＞B＞C＞G＞D＞E＞F＞H，整体看来碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶。

表1 不同蛋白酶对豆粕小肽含量的影响

2.3 不同蛋白酶对豆粕粗蛋白质含量的影响

豆粕中分别添加酸碱性不同的蛋白酶进行酶解反应，酶解试验结束后，烘干粉碎，取样进行粗蛋白质含量测定。结果如表2所示，豆粕原料的粗蛋白质含量为43.31%，被酸碱性不同的蛋白酶酶解40 h后，含量变化不明显，酶A～酶H依次增加1.31个百分点、0.15个百分点、0.8个百分点，减少1.94个百分点、3.2个百分点，增加0.61个百分点、0.94个百分点，减少1.57个百分点。

表2 不同蛋白酶对豆粕粗蛋白质含量的影响

3 讨论

豆粕是畜牧行业中优质蛋白质来源之一，存在不易消化利用等问题，需要借助酶制剂解决。本试验使用8种酸碱性不同的蛋白酶分别对豆粕进行酶解试验，研究不同蛋白酶的酶解效果。龚阿琼等[6]的试验表明，使用蛋白酶可有效降解抗原蛋白，提高豆粕中蛋白质消化利用率。王之盛等[10]认为，还需要考虑不同酸碱性条件对酶解能力的影响。本试验使用8种酸碱性不同的蛋白酶进行试验，通过抗原检测结果得出，酶解参数一致时，碱性蛋白酶去除抗原蛋白更有效。可能是因为豆粕在酶解过程中产生胺类等碱性物质[11]，使酶体系pH更适合碱性蛋白酶作用。抗原蛋白是以复杂方式连接的复合体，推测单一酶制剂难以充分破坏其结构[6]，因此多种酶制剂的协同效果可能更好。在本试验中，使用碱性蛋白酶和果胶酶复合处理豆粕中的抗原蛋白，效果并没有明显好于单独使用蛋白酶，但这只是在本试验条件下的结果，不能推翻多种酶制剂的协同效果可能更好的猜测。宋士良等[12]用中性蛋白酶降解豆粕，小肽含量由3.38%上升到18.34%。Hong等[13]研究发现，发酵后豆粕中的大分子蛋白有一部分降解为小于20 kDa的小分子肽类。本试验小肽含量增多，主要是由于发酵时蛋白酶将豆粕中大分子蛋白质降解成活性小分子肽、有机酸等小分子物质[14-15]，小肽增多更有利于动物消化吸收，提高豆粕利用率，减少有害微生物的繁殖[1]。毛银等[16]采用菌酶协同方法发酵豆粕，经乳酸菌和中性蛋白酶37 ℃发酵48 h后，肽含量提高了223%，粗蛋白质含量提高了6.23%。理论上酶解不会影响粗蛋白质含量，粗蛋白质的波动是由水分的不同造成的，水分高蛋白质含量低，水分低蛋白质含量高。本试验小肽含量提高有限，粗蛋白质含量几乎无变化，酶解条件有很大的优化空间。

4 结论

综上所述，采用蛋白酶酶解豆粕时，碱性蛋白酶效果最好，能将大分子蛋白降解成小分子肽，清除β-伴球蛋白和酸性亚基。酶解效果除受酶本身的影响外，还受酶添加量、酶解条件等多种因素的影响，因此如何有效降低或者完全去除豆粕中的抗原蛋白，可以在使用碱性蛋白酶的基础上继续深入研究。