贵阳地区1 163例脊髓性肌萎缩症筛查现状及基因诊断策略分析

李媛媛，马星卫，韩媛媛，黄盛文

1.贵州省人民医院检验科，贵州贵阳 550002；2.贵州省人民医院产前诊断中心，贵州贵阳 550002；3.贵州大学医学院，贵州贵阳 550025

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy,SMA）是一种神经肌肉疾病，属于常染色体隐性单基因遗传病[1]。2018年5月，脊髓性肌萎缩症被列入国家卫生健康委员会等部门联合制定的《第一批罕见病目录》[2]。婴幼儿期起病的患儿，很大概率无法活到2岁。因此，SMA也被称为2岁以下婴幼儿的头号致死性遗传病。据统计，SMA在活产婴儿的发病率为1/10 000～1/6 000[3]，SMA缺陷基因的人群携带率为1/40～1/50[4]。虽然SMA可防可治，但鉴于SMA患者病情严重、人群携带率高、危害性大以及昂贵的治疗费用，现阶段携带者筛查、产前诊断仍然是主要的预防手段，携带相同致病基因的父母通过产前诊断或第三代试管婴儿的方法就可以阻断患儿的出生。因此，美国医学遗传学会（ACMG）、美国妇产科学会（ACOG）在先后发布了多个携带者筛查的指南，强烈建议每一位计划怀孕或已怀孕女性筛查SMA[5-8]。本研究于2018年1月—2019年12月对贵阳地区贵州省人民医院1 163例孕妇人群进行了首次大样本量SMA携带者筛查。其筛查流程和经验或将有助于SMA遗传咨询和产前基因诊断在贵阳地区的推广，对于优生优育、有效预防SMA胎儿的出生具有重要的临床意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对常规产检的13 478例孕妇进行SMA携带者筛查宣教，其中1 163例表型正常的孕妇自愿接受筛查，接受率约为8.62%。回顾性分析孕妇临床资料，年龄17～44岁，平均（29.74±2.1）岁；孕周10～24周，平均（17.8±2.3）周。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：表型正常、无SMA家族史、自愿接受筛查的孕期女性。排除标准：使用肝素抗凝的全血样本。

1.3 方法

①样本釆集受检者外周静脉血2 mL，枸橼酸钠或EDTA抗凝，置于2～8℃冷藏条件下保存，并在1周内完成检测。

②DNA提取采用核酸提取试剂提取外周血基因组DNA，NanoDrop Lite分光光度计测定DNA浓度，要求纯度（A260/A280）为1.7～2.0，浓度为2.0～180 ng/μl。-20℃保存，避免反复冻融。

③基因检测运用多重荧光定量PCR技术（自建方法），对运动神经元存活基因（survival motor neuron 1,SMN1）拷贝数进行检测。PCR扩增条件为：UNG酶50℃反应1 min；95℃预变性5 min，95℃变性15 sec，60℃延伸35 sec，共40个循环；报告基团VIC、CY5。

④结果判断根据比较Ct法进行SMN1基因拷贝数的定量分析，纯合缺失型、杂合缺失型和正常型对应的SMN1基因拷贝数分别为：0、1和2。计算公式如下：待测样本（或对照样本）目的基因△Ct=Ct_目的基因-Ct_参比基因；待测样本目的基因△△Ct=△Ct_待测样本-△Ct_对照样本；待测样本目的基因RQ值（Expression值）=2-△△Ct。

⑤产前诊断若孕妇检测为SMA携带者，则对其配偶进行携带者筛查；若夫妇双方均为SMA携带者，经知情同意后于孕16～22周，在B超引导下经腹壁行羊膜腔穿刺术，用一次性无菌注射器缓慢抽取羊水10 mL，按上述方法和DNA测序法同时对胎儿的SMN1基因进行检测。分娩后提取胎儿组织基因组DNA，检测SMN1基因以进一步证实产前诊断的结果。

⑥随机抽取经自建方法检测为纯合缺失型、杂合缺失型和正常型的样本各5例，送第三方实验室进行多重连接探针扩增技术（multiplex ligationdependent probe amplification,MLPA）检测，比较两种方法结果的一致性。

1.4 观察指标

试验数据采用四格表进行处理，计算阳性符合率、阴性符合率、总符合率。阳性符合率=100%[a/(a+c)]，阴性符合率=100%[d/(b+d)]，总符合率：是评估检测结果和明确诊断结果总一致程度的指标，它是所有检测结果中真正的阳性结果和真正的阴性结果所占的百分比。总符合率=100%[(a+d)/n]。见表1。

表1 比较两种方法结果的一致性

1.5 统计方法

采用Excel 16.64分析数据。配对卡方（χ2）检验：说明的是检出率或阳性率的高低是否相同。Kappa检验：说明的是被考核试剂与对比试剂/对比方法检测结果的一致性程度。

2 结果

2.1 样本SMN1基因检测结果

所有样本均检测成功，通过对SMN1基因外显子7的定量检测，可检出SMN1基因纯合缺失型、杂合缺失型和正常型，对应的SMN1基因拷贝数分别为0、1和2。见图1。

图1 SMN1基因PCR检测结果

续图1

2.2 1 163例产检孕妇SMA携带 率

对13 478例孕妇进行SMA携带者筛查宣教，仅有1 163例孕妇自愿接受筛查，接受率为8.62%。在接受筛查的1 163例产检孕妇中，检出26例为SMA携带者，携带率为1/45(检出率2.24%)。经遗传咨询，12例携带者的配偶自愿接受SMA筛查，接受率为46.15%。最终检测出同为SMA携带者的夫妇2对。

2.3 SMA产前诊断

对2例高风险胎儿进行产前基因诊断，孕18周时行羊水穿刺，胎儿SMN1基因产前诊断结果：其中1例为纯合缺失，基因拷贝数为0，确诊为SMA胎儿，根据孕妇夫妇意愿选择终止妊娠；另外1例为杂合缺失，基因拷贝数为1，确诊为携带者，出生后随访1年发育未见异常。

2.4 MLPA验证SMN1

基因纯合缺失型、杂合缺失型和正常型全部检出，两种方法的一致性为100%。见图2。

图2 SMN1基 因MLPA结果

3 讨论

由于中国人口基数庞大，罕见病在我国并不“罕见”，而SMA又属于罕见病中的常见病。中国目前已有SMA患者近3万例，根据每年大约1 600万的新生儿出生计算，每年新增SMA患儿1 700～2 800例。近年来，随着更多基因治疗药物的普及，为SMA患者和家庭带来了新的选择，国家对SMA的关注也逐渐提高，先后出台多个专家共识和指南对SMA的筛查、诊断及治疗作出了明确指导[9-11]。

本研究对13 478例孕妇进行SMA筛查的宣教，有1 163例自愿接受筛查，接受率为8.62%。这是贵阳地区首次大样本量的SMA携带者筛查，但接受率低于国内大部分地区，2021年江苏地区的接受率为34.90%，10年前台湾地区报道的接受率为10.60%[12-13]，究其原因可能是本地区人群对遗传性疾病认识程度较低，缺乏疾病相关知识的科普，未能引起人们的普遍重视。在接受筛查的孕妇中检出26例SMA携带者，携带率为1/45，与其他研究结果一致[14]。经遗传咨询，12例携带者的配偶自愿接受SMA筛查，接受率为46.15%，由此可见，加强SMA携带者筛查和遗传咨询有利于提高人群接受程度。目前，贵阳地区在SMA的研究方面仅有少数医院为已怀孕妇女提供SMA的携带者筛查，较少有基因诊断方面的研究。因此，为有效控制贵阳地区SMA患儿的出生，提高人口素质，减轻家庭及社会的负担，有必要在贵阳地区建立完善的基因诊断方法，健全产前筛查与产前诊断流程，为全面开展SMA的防控提供基础数据和技术支持。

在中南大学的一项研究中发现，“2+0”“1+1D”和“2+1D”3种基因型携带者占SMA携带者的7.5%，另外还有1.7%的新发突变[15]。因此，进行完善的遗传咨询、全面的风险评估以及建立有效的基因检测体系十分关键。①通过宣教使备孕或已孕女性了解SMA的临床表现和严重程度，提高筛查接受度；②签署知情同意书，告知检测目的、方法及局限性，自愿接受筛查；③根据筛查结果，对携带者的配偶进行SMA筛查；④为高风险夫妇提供产前基因诊断和生育指导，并对筛查结果为阴性的受检者进行残余风险评估；⑤开展新生儿筛查，促进SMA的早期诊断和治疗，争取更好的临床结局。