miR-221与宫颈鳞状细胞癌肿瘤标志物联合检测的统计学分析

中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所生物治疗室(110001)

蒋 涛△ 李 妍 孟凡东 隋承光

【提 要】 目的 运用统计学方法探讨宫颈鳞状细胞癌患者血清中miR-221联合CEA、CD109及SCCA检测在临床诊断中的应用价值。方法 UALCAN数据库获取miR-221和CD109在宫颈鳞状细胞癌患者中的表达水平及其与淋巴结转移的关系；采集患者外周血，提取血清，实时荧光定量PCR分析血清中miR-221和CD109的表达；免疫化学发光法检测血清中CEA和SCCA的表达水平；logistic多因素回归分析miR-221、CEA、CD109及SCCA的诊断价值；Pearson相关性分析各指标之间的相关性；分析单项检测及联合检测的灵敏度、特异度及准确度。结果 miR-221、CEA、CD109及SCCA在宫颈鳞状细胞癌患者中均呈高表达状态(P<0.05)；logistic多因素回归分析显示miR-221、CEA、CD109及SCCA均对宫颈鳞状细胞癌具有诊断价值(P<0.05)；Pearson相关性分析结果显示，各指标之间均具有显著的相关性(P<0.01)；联合检测的灵敏度均高于各项指标的单项检测结果，准确度高于miR-221和CD109的单独检测结果，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 联合CEA和SCCA检测能够更有效提高宫颈鳞状细胞癌的早期检出率，在临床诊断中具有重要的应用价值。

宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤之一[1]，其死亡原因主要是肿瘤细胞的浸润和转移。早期诊断对于宫颈癌的治疗及预后改善极为重要。肿瘤标志物在正常人的体内含量极低，但在肿瘤患者体内的含量却较高，因其检测操作简便，易于被患者接受，广泛应用于肿瘤的筛查和诊断中。但单个肿瘤标志物对于疾病的诊断往往灵敏度较低，为提高早期诊断率和治疗效果，临床通常联合检测肿瘤标志物的表达水平预测癌细胞侵袭及转移能力，为肿瘤患者的早期治疗提供有利时机。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类由内源基因编码的长度为18～25个核苷酸的非编码单链RNA分子，在细胞内具有重要的调节作用[2]。miRNA可通过在转录或转录后水平调控促癌或抑癌相关基因的表达而广泛参与恶性肿瘤进程[3]。研究发现，miR-221可以诱导肿瘤细胞的上皮间质转化(EMT)，尤其在宫颈鳞状细胞癌中，促进了肿瘤细胞的增殖[4]。鳞状细胞癌抗原(SCCA)是具有相对较高特异性的一种抗原标志物，是诊断宫颈鳞癌的首选肿瘤标志物。有研究表明，检测SCCA可以用于监测宫颈癌患者的病情改变情况，也是制定辅助治疗方案的参考依据[5]。miR-221联合多种抗原标志物检测宫颈鳞状细胞癌，将有效提高患者的早期诊断率。

材料与方法

1.一般资料

选取2017年1月至2020年12月中国医科大学附属第一医院肿瘤内科和妇科CSCC患者70例作为患者组。70例宫颈息肉患者作为疾病对照组。筛选70例健康志愿者作为健康对照组。

纳入标准：经病理及影像学诊断确诊的患者；年龄大于18岁；健康对照组人群均为经过血液及超声等相关检查符合健康人群标准。排除标准：患有心理及精神疾病的患者；患有心脑血管疾病的患者；患有免疫系统疾病者；合并其他肿瘤患者；接受过放化疗的患者；妊娠及哺乳期女性。

2.临床数据及标本的采集方法

利用UALCAN数据库(http：//ualcan.path.uab.edu/)获得miR-221和CD109在宫颈鳞状细胞癌患者中的表达数据及生存分析图谱。所有研究对象均采集清晨空腹静脉血5ml，离心，3000 r/min，留取上层血清，用于后续实验。

3.检测方法

应用罗氏全自动分析仪，采用免疫化学发光法检测所有研究对象血清中CEA和SCCA的表达水平。正常参考值：CEA<5μl/L；SCCA<2.5μg/L。

采用实时荧光定量PCR检测血清中miR-221和CD109的相对表达水平。miR-221的引物序列上游：5′-GGACCACCGCTCATCGCTAA-3′，下游：5′-GTTACTATATGCCAAGCCCTAG-3′；CD109得引物序列上游：5′-ACATGATCTCAATCATGTGG-3′，下游：5′-ACACTGAAGCATCTTGGG-3′；内参U6的引物序列上游：5′-CTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游：5′-AAAATATGGAACGCTTCACG-3′。采用2-△△Ct法计算miR-221、CD109的相对表达量。

4.统计学方法

本实验中所有数据均采用SPSS 22.0软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差表示。样本不满足正态性检验，选择Mann-Whitney U检验。应用R软件包ggplot2分析数据库中样本的差异。采用单因素方差分析法进行组间的差异性比较，两组间的差异比较应用t检验进行分析。多因素分析采用logistic回归模型。应用Pearson相关性分析各指标的相关性。计算单独诊断及联合诊断的敏感度和特异度：敏感度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%；特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%；准确度=(真阳性+真阴性)/(真阳性+假阳性+真阴性+假阴性)×100%，联合检测时任意阳性结果为阳性。P<0.05视为差异具有统计学意义。

结 果

1.miR-221在CSCC患者中的表达

miR-221在宫颈鳞状细胞癌中的表达水平(398.041±38.429)/million明显高于正常对照组(241.956±29.623)/million(P<0.01)，且有淋巴结转移的患者中miR-221的表达水平(503.474±49.189)/million也高于无淋巴结转移的患者(381.157±43.292)/million及健康对照组(241.956±29.623)/million，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.CD109在CSCC患者中的表达

CD109在宫颈鳞状细胞癌患者中的表达水平(11.913±3.492)/million明显高于正常对照组(9.468±2.439)/million，且差异有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移的患者中CD109的表达水平(12.491±3.128)/million明显高于健康对照组(9.468±2.439)/million，差异有统计学意义(P<0.05)。

3.各组血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表达情况

CSCC患者组和疾病对照组患者血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表达水平均高于健康对照组(P<0.05)，且CSCC患者组高于疾病对照组(P<0.05)，差异均具有统计学意义(表1)。

表1 血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表达水平

4.CSCC的诊断因素

以肿瘤是否发生为因变量，以CESC患者组和健康对照组为对象，logistic多因素回归分析显示miR-221、CEA、CD109及SCCA均对宫颈鳞状细胞癌的诊断有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 CSCC诊断因素的logistic回归分析

5.血清miR-221、CEA、CD109及SCCA表达水平之间的相关性

Pearson相关性分析得出，血清中miR-221、CEA、CD109及SCCA的表达水平之间均具有显著的相关性(P<0.01，表3)。

表3 血清miR-221、CEA、CD109及SCCA表达水平之间的相关性

6.血清miR-221、CEA、CD109、SCCA单项检测及联合检测对CSCC诊断的价值分析

从血清miR-221、CEA、CD109及SCCA单独检测的灵敏度、特异度及准确度分析，CEA和SCCA的准确度均高于miR-221和CD109的单独检测结果(表4)。因此选择CEA和SCCA联合检测(并联检测)，探讨联合检测对CSCC的诊断价值。

表4 血清miR-221、CEA、CD109、SCCA单项检测对CSCC的诊断价值

CEA和SCCA联合检测的灵敏度、特异度及准确度分别为94.29%、77.14%和85.71%，其灵敏度和准确度均高于单项检测结果，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

宫颈癌是威胁全球女性健康的主要疾病之一，其发病率日渐增高，全球每年约有50万女性被确诊为宫颈癌，且5年内生存率不足50%[6]，病因复杂，其中高危型人类乳头瘤病毒(HPV)持续感染是主要致病因素。近年来随着筛查技术的发展及HPV疫苗的应用，已有效控制及治疗部分患者，宫颈癌根治手术及同步放化疗技术也日趋成熟，但多数局部晚期及复发转移患者并无法受益，仍有多数肿瘤患者发展成为晚期癌症。因此，寻找更多的癌前病变指标及早期诊断指标，探讨宫颈癌不同病理类型间的表达差异对临床诊断及治疗具有重要意义。

近年有研究[7]显示，miRNA在肿瘤发生发展中起重要作用，miRNA可通过调控下游靶基因的表达，参与信号通路，发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用。几乎全部肿瘤细胞中均可检测到miRNA的异常表达，基于miRNA的靶向治疗也已成为近年来肿瘤治疗研究的热点。目前在宫颈癌患者中已发现许多异常表达的miRNA参与了宫颈癌的发生发展[8]。miR-221可通过对GHR、PUMA、Bmf、DDIT4等癌基因的调控影响细胞的增殖、分化及凋亡，进而影响肿瘤的发生和进展。本文通过数据库获得相关数据显示，宫颈鳞状细胞癌患者组织中，miR-221的表达明显高于正常健康人群，其中淋巴结转移患者的miR-221表达水平明显高于无淋巴结转移的患者和健康对照组人群。本实验检测了宫颈鳞状细胞癌患者血清中miR-221的水平，分析发现血清中miR-221的表达水平明显高于宫颈息肉患者的表达水平。说明miR-221有可能作为癌基因在宫颈鳞状细胞癌中发挥作用。

白细胞分化抗原109(CD109)是一种细胞表面抗原，属于α2-巨球蛋白家族成员，在鳞状细胞癌进展中属于具有高风险性的分子标志物。在胶质瘤、鳞状细胞癌、基底细胞样乳腺癌等多种肿瘤中均呈高表达状态[9]。本实验验证了CD109在宫颈鳞状细胞癌患者血清中的表达水平，结果显示，CSCC患者血清中CD109的水平明显高于宫颈息肉患者，可见，CD109可作为宫颈鳞状细胞癌的特异性标志物。

CEA为一种特异性胚胎抗原酸性蛋白，可通过促进癌细胞DNA分裂途径，增加癌细胞浸润风险，也是肿瘤患者常见的检测标志物[10]。血清鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)作为一种特异性较好的宫颈癌标志物，能参与细胞基因调控、基质降解，特异性反映细胞增殖、浸润与转移情况[11]，已广泛应用于宫颈癌的诊断中。但单独检测CSCC患者血清SCCA水平，对于诊断宫颈癌的灵敏度较低，不利于宫颈癌的有效检出。由于早期宫颈癌患者无明显临床症状，且发病缓慢，症状一旦出现，往往错过最佳治疗时机，严重影响了患者的治疗效果及预后。研究表明，CSCC患者血清中SCCA水平的增高，与患者的临床分期、分化程度、淋巴结转移、肿瘤浸润深度及肿瘤大小等均存在一定的相关性，而且SCCA的水平还会随着患者宫颈癌肌层浸润深度的不断加深而逐渐增高[12]。

通过相关性分析得出，血清中各指标的表达水平之间存在显著的相关性，因此，本实验联合检测CSCC患者血清中CEA和SCCA的水平，发现其联合检测的灵敏度均高于各项指标的单项检测结果，准确度高于miR-221和CD109的单独检测结果。可见，联合检测CSCC常见的肿瘤标志物检测提高了宫颈鳞状细胞癌的早期诊断效率，也为临床上早期诊断CSCC提供了一定的理论数据。