酶联免疫吸附法测定药食同源中药饮片中黄曲霉毒素的研究

中药材在生产、运输、储存过程中容易受到黄曲霉的侵染从而产生黄曲霉毒素[1]。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素，主要分为B族和G族两种，其中以黄曲霉毒素B1的毒性最大，致癌性最强。

目前黄曲霉毒素的检测方法有薄层色谱法、色谱分析法和免疫分析法[2]。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版将酶联免疫法列入2351通则中真菌毒素测定法的黄曲霉毒素测定法，为中药材、中药饮片及中药制剂中黄曲霉毒素的测定提供了新的检测方法。黄曲霉毒素在食品中的研究较为广泛，而在中药饮片的研究仍较少。传统的色谱分析方法有着灵敏度高、重复性好的优势，但操作复杂不利于大批次快速检测。随着酶联免疫吸附法的发展与应用，能快速、简便地测定出样品中的黄曲霉毒素，为黄曲霉毒素的检测提供了便捷的检测手段，有利于大批次快速筛查出中药饮片中的黄曲霉毒素。本文通过建立酶联免疫吸附法，考察其在中药饮片中黄曲霉毒素检测的应用，并对检测结果进行探讨研究。

1 材料与方法

1.1 材料

中药饮片，珠海市场销售。

1.2 试剂

甲醇，分析纯；乙腈、正己烷、三氯甲烷，分析纯；超纯水；黄曲霉毒素B1残留酶联免疫检测试剂盒（北京勤邦生物技术有限公司，批号：S220223A10）；黄曲霉毒素总量残留酶联免疫检测试剂盒（批号：S220223A10，北京勤邦生物技术有限公司）；黄曲霉毒素B族和G族混标溶液（批号：S 095875；含量：黄曲霉毒素B199.9%；黄曲霉毒素B299.9%；黄曲霉毒素G199.7%；黄曲霉毒素G299.7%；天津阿尔塔科技有限公司）以及黄曲霉毒素B1标准溶液（批号：GBW（E） 100302；含量：100%；国家粮食和物资储备局科学研究院）。

1.3 仪器设备

Multiskan FC型酶标仪，赛默飞；Centrifuge-V型离心机，赛默飞；XSR205电子分析天平型，梅特勒-托利多；N-EVAP24氮吹仪型，Organomation；888型洗板机，赛默飞。

1.4 实验方法

1.4.1 样品和试剂的制备

（1）中药饮片样品。将中药饮片用打粉机粉碎，混匀，称取供试品粉末约2.0 g，参照《中国药典》2020年版四部通则2351真菌毒素测定法，黄曲霉毒素测定法第三法（酶联免疫法）制备样品[3]。

（2）样品复溶工作液、酶结合物工作液及洗涤工作液。参照酶联免疫试剂盒说明书[4-5]。

（3）混合对照品溶液的制备。①黄曲霉毒素混合对照品溶液：精密量取黄曲霉毒素B族和G族混标溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0 μg·mL-1、0.3 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1和0.3 μg·mL-1）1 mL，置于100 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，作为黄曲霉毒素混合对照品溶液。

（4）黄曲霉毒素B1对照品溶液的制备。精密量取黄曲霉毒素B1对照品溶液（黄曲霉毒素B1标示浓度为1.96 μg·mL-1）1 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为黄曲霉毒素B1对照品贮备溶液。

1.4.2 酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1含量

在96孔反应板中分别加入标准品、样品50 μL到对应微孔中，然后加入黄曲霉毒素B1酶结合物工作液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后于25 ℃避光反应45 min。揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250 μL/孔，充分洗涤5次，每次间隔10 s，弃去洗涤液，用吸水纸拍干。每孔依次加入底物显色A液50 μL，再依次加入底物显色B液50 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后于25 ℃避光反应15 min。最后每孔依次加入终止液50 μL，轻轻振荡混匀后，采用酶标仪测定每孔吸光度值，仪器参数为测定波长450 nm，参比波长620 nm。

1.4.3 酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素总量

在96孔反应板中分别加入标准品、样品20 μL到对应微孔中，然后加入黄曲霉毒素总量酶结合物工作液80 μL/孔，按1.4.2操作步骤处理。黄曲霉毒素总量以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计算。

1.5 方法学验证

1.5.1 标准曲线的绘制

将浓度为0 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.15 μg·mL-1、0.45 μg·mL-1和1.35 μg·mL-1的 黄 曲 霉 毒 素B1系 列标 准 品 溶 液，浓 度 为0 μg·mL-1、0.025 μg·mL-1、0.075 μg·mL-1、0.225 μg·mL-1和0.675 μg·mL-1的黄曲霉毒素总量系列标准品溶液，按试剂盒操作步骤处理，测定吸光度值。以标准品溶液浓度的对数值（lgC）为横坐标，对应标准品溶液的百分吸光率为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5.2 检测限

实验以酶联免疫法分别检测6份阴性的样本，计算阴性样本中黄曲霉毒素B1及黄曲霉毒素总量的含量，方法的检出限等于阴性样本的检测平均值加上阴性样本检测浓度的3倍标准偏差。

1.5.3 精密度实验

分别取浓度为1.35 μg·mL-1的黄曲霉毒素B1标准品溶液、浓度为0.675 μg·mL-1的黄曲霉毒素总量标准品溶液，按试剂盒操作步骤处理，各平行6孔，测定吸光度值，计算其相对标准偏差。

1.5.4 回收率实验

准确称取薏苡仁供试品2组，每组各6份，每份样品约2 g，置于50 mL离心管中，第一组加入黄曲霉毒素B1对照品溶液1 mL，第二组加入黄曲霉毒素混合对照品溶液1 mL，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，按试剂盒操作步骤处理，每份平行2孔，测定吸光度值并计算百分吸光率，由标准曲线回归方程计算各成分浓度，计算回收率及其RSD值。

2 结果与分析

2.1 酶联免疫测定中药饮片中黄曲霉毒素B1的结果

2.1.1 线性方程

由表1可知，黄曲霉毒素B1在0～1.35 μg·mL-1，浓度的对数与其百分吸光率呈现良好的线性关系。

表1 黄曲霉毒素B1线性方程数据表

2.1.2 检测限

由表2可知，黄曲霉毒素B1方法检出限为1 μg·kg-1，方法灵敏度高。

表2 黄曲霉毒素B1检出限测定结果表

2.1.3 精密度实验

由表3可知，黄曲霉毒素B1试剂盒的RSD为13%，符合方法分析验证精密度限度范围。

表3 黄曲霉毒素B1精密度测定结果表

2.1.4 回收率实验

由表4可知，薏苡仁黄曲霉毒素B1的加标回收率在100.8%～118.9%，符合方法分析验证回收率限度范围。

表4 黄曲霉毒素B1回收率测定结果表

2.1.5 样品测定结果

根据黄曲霉毒素B1的检出限为1 μg·kg-1，由此可得出当检测结果低于或等于1 μg·kg-1时可判定为未检出，当检测结果高于1 μg·kg-1时可判定为黄曲霉毒素B1阳性。而编号为2、5、8、24、25和26的样品，测得的结果稍高于1 μg·kg-1，按照修约规则可认为其结果为1 μg·kg-1，而且其目测颜色与其他未检出的样品颜色一致，可根据目测颜色的结果判定为未检出，检测结果见表5。

表5 中药饮片中黄曲霉毒素B1检测结果表

2.2 酶联免疫测定中药饮片中黄曲霉毒素总量的结果

2.2.1 线性方程

由表6可知，黄曲霉毒素总量在0～0.675 μg·mL-1，浓度的对数与其百分吸光率呈现良好的线性关系。

表6 黄曲霉毒素总量线性方程数据表

2.2.2 检测限

由表7可知，黄曲霉毒素总量方法检出限为0.5 μg·kg-1，方法灵敏度高。

表7 黄曲霉毒素总量检出限测定结果表

2.2.3 精密度实验

由表8可知，黄曲霉毒素总量试剂盒的RSD为13%，符合方法分析验证精密度限度范围。

表8 黄曲霉毒素总量精密度测定结果表

2.2.4 回收率实验

由表9可知，薏苡仁黄曲霉毒素总量加标回收率在84.6%～90.5%，回收率较好，符合方法分析验证回收率限度范围。

表9 黄曲霉毒素总量回收率测定结果表

2.2.5 样品测定结果

根据黄曲霉毒素总量的检出限为0.5 μg·kg-1，由此可得出当检测结果低于或等于0.5 μg·kg-1时可判定为未检出，当检测结果高于0.5 μg·kg-1时，可判定为黄曲霉毒素总量阳性，检测结果见表10。

表10 中药饮片中黄曲霉毒素总量检测结果表

3 结论与讨论

3.1 讨论

《中华人民共和国药品管理法》的第三条要求“药品管理……全面提升药品质量，保障药品的安全、有效、可及”，国家“十四五”规划中也提到了要“严格食品药品安全监管”，国家药监局药监综药注函〔2022〕87号关于《中华人民共和国药品管理法》第一百一十七条第二款适用原则的指导意见就是充分考虑了中药饮片的特点作出的专门规定[6]，广东省药监局在2021年印发了《广东省药品监督管理局中药饮片不符合药品标准尚不影响安全性、有效性的认定指导原则》，其中就提到了“影响中药饮片安全性的检验项目有二氧化硫残留量、重金属及有害元素、农药残留量、真菌毒素……”。中药药材是中药产业的原料，中药饮片是一种处方药。中药饮片主要用在中医临床辨证论治的治疗中，也是中医用药效果的主要保障。中药饮片的质量和中医的临床疗效具有密切的关系，安全质量问题甚至会影响到用药的安全性。而中药饮片的质量和中药的发展不可分开，中药的发展可弘扬中医文化，具有高度的重要性。

为了适应监管需求，本实验选取了31批次共26个品种的中药饮片作为检测对象，其中大部分为药食同源的中药饮片。市面上大部分药食同源的中药饮片常被用作食品，其来源和质量参差不齐，虽然食品安全国家标准、《中国药典》及行业标准等多个标准可作为药食同源食品质量控制研究的依据，但这些标准并不完全适用于药食同源食品的质量控制，所以其安全性更加难以保证。绝大部分被用作药食同源中药饮片含有大量淀粉、糖类、蛋白质等容易发生变质的成分，储存不当很容易产生霉变，因此安全问题更加值得关注。食品中黄曲霉毒素检测的相关规定有很多，而这部分被用作药食同源的中药饮片的归属性不在食品安全中，导致安全检测容易被忽视，2020年版《中国药典》项下规定要检测黄曲霉毒素的品种仅有25种，在与众多品种的中药饮片相比之下，该范围少之又少，是否会存在未规定检测的品种检测出被污染黄曲霉毒素，该安全性问题也值得人们深思。所以，增加检测这类中药饮片中的黄曲霉毒素检测方法探索，可以为药食同源中药饮片进行科学、适宜、符合其使用特点的安全性评价研究提供一定的参考。

3.2 结论

在本次实验结果中，31批次的中药饮片，有5批次检出黄曲霉毒素B1、6批次检出黄曲霉毒素总量。《中国药典》规定中药饮片黄曲霉毒素B1的限量标准为5 μg·kg-1，黄曲霉毒素总量（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计）的限量标准为10 μg·kg-1[3]。根据试剂盒说明书及上述结果可得，黄曲霉毒素总量的灵敏度为0.025 μg·kg-1[5]，检 出 限 为0.5 μg·kg-1；黄 曲 霉 毒 素B1的 灵 敏 度 为0.05 μg·kg-1[4]，检出限为1 μg·kg-1。故当检测结果超出检出限时，可认为其黄曲霉毒素检出阳性。酶联免疫测定法是通过测定其吸光值计算出黄曲霉毒素的含量，由于中药饮片中含有多种复杂的成分，致使其提取液中含有各种杂质和色素，部分杂质和色素能与抗原抗体结合，且在特定的波长下存在一定的吸收，还有其他各种不确定因素的影响，有可能出现假阳性的检测结果。虽然酶联免疫测定法用于快速筛查能定量检测出黄曲霉毒素含量，其结果具有一定的不准确性，结果确证仍需要通过液相色谱-串联质谱法进行确认。