一种消减酱豆中游离酪氨酸的耐盐菌的筛选及应用研究

黄豆酱是一类以大豆和面粉为主要原料，经米曲霉等微生物发酵而成的一种色、香、味俱全的传统发酵食品。黄豆酱中人体所需的营养物质比较丰富，这些营养物质经微生物分解后，更容易被人体吸收，也可以改善人体的肠道环境。在黄豆酱发酵过程中，许多微生物起着重要作用，米曲霉是主要的微生物，也包括芽孢杆菌、乳酸菌、霉菌、酵母菌等。

我国豆酱种类中黄豆酱的产量最大，对黄豆酱的整个发酵过程的研究比较深入。黄豆酱主要采用米曲霉进行制曲，大曲成熟后，与盐水混合，制成黄豆酱胚。黄豆酱胚的盐分较高，使得大量霉菌生长受到抑制，进而导致其呼吸代谢逐渐减弱直至停止，但有些适应该环境的耐盐或耐酸微生物开始大量繁殖。发酵初期的黄豆酱胚中，米曲霉分泌的各种酶发挥了主要作用。原料中的蛋白质被蛋白酶、肽酶降解为多肽、氨基酸等小分子物质[1]；淀粉、纤维素等多糖物质被淀粉酶降解为小分子的葡萄糖。黄豆酱发酵中期，耐盐酵母菌和乳酸菌利用发酵初期形成的葡萄糖等物质代谢生成乙醇、乳酸等呈味物质。在黄豆酱的发酵后期，需定期翻、晒、露，以便通过阳光紫外线照射，使温度白天高晚上低，形成温度差，进而使发酵黄豆酱胚中各种有益菌种得到繁殖和生长，增加酱豆酯香。

传统的黄豆酱酿造工艺都是先将黄豆浸泡好，去掉泡豆水后将黄豆蒸煮，然后再进行制曲和发酵，制成黄豆酱胚。但在黄豆酱发酵过程中，物料在蛋白酶、肽酶等酶的作用下，分解成多肽和氨基酸，氨基酸中的酪氨酸因溶解度仅为0.045%，很容易在酿造过程中析出，产生白点，严重影响黄豆酱的外观品质[2-3]。

制曲过程中大曲发酵产生的酶系难以控制，无法直接控制蛋白质的水解过程不产生酪氨酸[4-5]。因此，为减少发酵产物中的酪氨酸水平，采取“添加消耗酪氨酸的耐盐菌”的工艺，在后发酵过程中分解利用酪氨酸为氮源。这样既减少了发酵产物中的酪氨酸，亦不增加发酵成本，提升了黄豆酱发酵产物的感官品质，降低了黄豆酱在酿造过程中的白点风险，提升了黄豆酱整体经济效益。

本文通过筛选消减酪氨酸的耐盐菌，用于黄豆酱酿造工艺。在黄豆酱发酵过程中，耐盐菌消耗酱豆中游离的酪氨酸，有效降低黄豆酱发酵后期酱醪中游离酪氨酸的含量，使黄豆酱中游离酪氨酸的含量＜100 mg/100 g，从而避免了黄豆酱在货架期产生白点的风险[6-7]。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

酿造黄豆酱生产原料：黄豆、面粉、食盐从市场采购；沪酿3.042米曲霉菌种：由广东美味鲜调味食品有限公司提供；葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、麦芽汁培养基、MRS肉汤培养基和琼脂粉等从市场购买。

1.2 仪器与设备

超净工作台、培养箱、耐盐菌扩培系统、种曲机、NK式旋转蒸煮锅、发酵池、60 m³发酵罐等。

1.3 试验方法

1.3.1 分离培养基及分离方法

检测不同发酵罐中酪氨酸的含量，从低游离酪氨酸含量的发酵罐中取酱醪样品，进行分离。

耐盐乳酸菌的分离：MRS培养基（1 L）、食盐

100 g、碳酸钙3 g，采用包埋法进行分离。

耐盐酵母菌的分离：麦芽汁培养基（1 L）、食盐

100 g、琼脂粉20 g，采用平板涂布法进行分离。

1.3.2 耐盐菌的菌落形态和菌体显微形态

观察分离得到的耐盐菌的菌落形态，用牙签挑取少量菌体置于载玻片上，滴加少量的蒸馏水，盖上盖玻片，然后通过显微镜观察耐盐菌的显微形态。

1.3.3 小试规模确定目标耐盐菌消减游离酪氨酸的效果

①耐盐菌的制备。将目标耐盐菌按照现有工艺进行扩大培养，得到扩培液，备用。②酱醪的制备。取200 g成熟大曲，与浓度为18%的300 g盐水混合均匀，盛装于1 L三角瓶中，制得新鲜的酱醪。③耐盐菌的添加。菌种的添加比例为酱醪的5%；试验一：将耐盐酵母菌添加于新鲜的酱醪中；试验二：将耐盐乳酸菌添加于新鲜的酱醪中；试验三：将耐盐酵母菌和乳酸菌分别按照5%酱醪比例添加至同一瓶的新鲜酱醪中，添加自来水于酱醪中的样品为对照样品。④酱醪发酵。将酱醪于30 ℃左右进行发酵，分别取发酵时间为7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和63 d的酱豆样品，送检样品的游离酪氨酸指标，根据游离酪氨酸的含量变化，确认分离得到的耐盐菌降低游离酪氨酸效果。

1.3.4 小试规模优化目标耐盐菌的添加工艺

分别取发酵时间为7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和63 d的酱豆样品，送检样品的游离酪氨酸指标，通过单因素试验，分别确定目标耐盐菌的最佳添加时间、添加量、添加后起效时间。

1.3.5 中、大试规模验证耐盐菌消减酪氨酸的效果

将筛选的目标耐盐菌按照生产工艺进行扩大培养，得到扩培液，备用。取成熟的大曲，与浓度为16%的盐水按照1∶2.0的比例进行混合制醪，泵至60 m³发酵罐中，将耐盐菌扩培液，分别按照5%的添加比例添加至酱醪中，以未添加扩培液的发酵罐为对照罐，常温发酵，取7 d、14 d、21d、28 d、35d、42 d、49 d、56 d和63 d的酱豆样品，检测主要理化指标。

1.3.6 各指标检测方法

（1）游离酪氨酸测定。参照GB 5009.124—2016使用高效液相色谱法[8]。

（2）理化指标测定。总酸参照GB 12456—2021使用自动电位滴定法测定；氨基酸态氮参照GB 5009.235—2016使用酸度计法测定；还原糖参照GB 5009.7—2016使用直接滴定法测定；盐分参照GB/T 5009.39—2003使用直接滴定法测定。

2 结果与分析

2.1 筛选得到的耐盐菌及其菌落形态和显微镜形态

由表1可知，一共分离得到了8株耐盐菌，其中有4株为酵母菌，1株为短杆菌，2株球形细菌，1株乳酸菌，分离得到的耐盐菌大部分为酵母菌。

表1 从新鲜酱醪中分离的菌种编号、形态和类型表

2.2 小试规模确定目标耐盐菌消减游离酪氨酸的效果

由表2可知，菌1和菌4分别添加到酱醪中，在发酵至20 d左右时，酱豆中游离酪氨酸含量大大降低，这两株耐盐菌消减酪氨酸效果最好。

表2 不同酱豆中游离酪氨酸含量变化情况表

2.3 小试规模优化目标耐盐菌的添加工艺

2.3.1 耐盐菌的添加时机确定

由表3可知，在发酵0 d、14 d、28 d、42 d的酱醪中添加耐盐菌，均能使酱豆中的游离酪氨酸下降，但在发酵0 d即投料当天添加耐盐菌，消减游离酪氨酸的效果最好。

表3 不同添加时机发酵酱豆中游离酪氨酸的含量表

2.3.2 耐盐菌的添加比例确定

由表4可知，按0.5%、1.0%添加到酱醪中消减酪氨酸的效果不明显，添加2.5%、5.0%和10.0%的耐盐菌到酱醪中降酪氨酸的效果明显。说明添加耐盐菌的量是降低酪氨酸的一个关键参数，菌量少，达不到降酪氨酸的效果。添加比例为2.5%时，消减酪氨酸效果也非常明显，但发酵前期还是存在高含量的游离酪胺酸，耐盐菌慢慢生长起来后，酪氨酸下降较快，但是存在白点隐患；5.0%和10.0%的添加量对降酪氨酸的效果差别不大，说明添加5.0%的耐盐菌已经饱和，添加5.0%以上的菌量对降酪氨酸的效果提升影响不大，故添加量最适为5.0%。

表4 不同添加比例发酵酱醪中酪氨酸的含量表

2.3.3 耐盐菌的起效时间确定

由表5可知，在发酵0 d添加耐盐菌，每周送检酱豆中游离酪氨酸，判断耐盐菌的起效时间。在发酵初期，0～7 d时，实验组酱豆中游离酪氨酸含量随着发酵时间的增加而增加，在发酵14～21 d，游离酪氨酸含量消减迅速，说明添加的耐盐菌在酱醪中14～21 d作用明显。

表5 确定消减酪氨酸的耐盐菌的起效时间表

由表1～5可知，在低酪氨酸的酱醪中筛选到了2株消减游离酪氨酸的耐盐菌，一株为酵母菌，另外一株为乳酸菌，对其关键参数进行验证，说明在发酵投料时就添加该2株耐盐菌，单个菌株添加量为5%，或者混合菌株添加量为5%时，对消减酱豆中的游离酪氨酸效果最好。添加该耐盐菌后，耐盐菌在发酵14～21 d，大大降低酱豆中游离酪氨酸，解决白点隐患。

2.4 目标耐盐菌添加到黄豆酱工艺的中试验证

由表6可知，与对照组相比，添加了耐盐菌菌1、菌4、菌1+菌4混合菌的试验组的黄豆酱中游离酪氨酸大大降低，几乎检不出来，且试验组的理化指标和风味、颜色与对照组没有明显区别。说明添加黄豆酱耐盐菌酵母菌，既能降低黄豆酱游离酪氨酸的含量，也没有对理化指标、风味、颜色等造成负面影响，筛选到的耐盐菌降酪氨酸效果较好，达到了预期目标。

表6 试验组与对照组发酵黄豆酱胚理化指标表

2.5 目标耐盐菌添加到黄豆酱工艺的大试验证

由表7可知，与对照组相比，添加了耐盐菌菌1、菌4、菌1+菌4混合菌的试验组的黄豆酱中游离酪氨酸大大降低，几乎检不出来，且试验组的理化指标和颜色与对照组没有明显区别，添加耐盐菌的风味均优于对照组，同时添加耐盐乳酸菌和酵母菌的酱豆风味优于添加单一耐盐菌的，酱香味更浓郁。

表7 试验组与对照组发酵黄豆酱胚理化指标表

3 结论

低酪氨酸含量的黄豆酱样品中，分离得到2株消减游离酪氨酸效果明显的菌株，分别为酵母菌和乳酸菌；将这2株耐盐菌同时用于黄豆酱酿造工艺，在酱醪配制阶段添加5%的耐盐菌，发酵20 d左右时，使黄豆酱中的游离酪氨酸含量控制在＜100 mg/100 g，从而避免了黄豆酱在货架期产生白点的风险。添加耐盐菌工艺酿造的黄豆酱在总酸、氨基酸态氮、盐分等主要理化指标方面与对照样无明显差异，黄豆酱风味有所提高，在解决黄豆酱白点的基础上提高了黄豆酱品质，实现了黄豆酱工艺的升级。