鸡矢藤乙醇提取液体外抑菌活性与体内抗炎镇痛作用研究

杨宁宇，江佳丽，梁淑荧，曾 琳，林红英，陈进军，康丹菊

（广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524088）

【研究意义】自2020 年起，促生长类药物及抗生素类饲料添加剂禁止使用于畜牧业，我国进入全面“禁抗”时代。但“禁抗”的同时带来一些问题，如畜禽在饲养和生产过程中将更易受到病原菌感染，生长速度也相对减缓［1-2］，因此寻找能够促生长的替抗品迫在眉睫。中草药具有来源广泛、药效多样、经济环保、毒副作用小、成本低廉、无抗药性、无残留等显著优势［3-4］，成为畜禽饲料添加剂的理想替抗品。鸡矢藤〔Paederia scandens(Lour.) Merr.〕是我国常见的一味中草药，为茜草科鸡矢藤属植物，常以根或全草入药，具有消食健胃、清热解毒、止痛等功效［5］。探 讨鸡矢藤乙醇提取物的体外抑菌活性和体内抗炎镇痛作用，可为鸡矢藤应用于畜禽疾病防治奠定基础，也可为开发中草药饲料资源提供参考。

【前人研究进展】鸡矢藤植物中含有多种生物活性物质［6-7］，其中主要化学成分可分为环烯醚萜苷类、黄酮类、挥发油类、三萜类、苯丙素类、烷烃、脂肪醇和脂肪酸类［8-9］。研究表明，在动物饲料中添加鸡矢藤提取物不仅可以提高动物的免疫力［10-11］、促进胃肠蠕动、改善厌食症［12-13］，而且还对鸡非酒精性脂肪肝病具有治疗作用［14］，通过滴鼻给药方式可促进鸡免疫器官的发育与增长［5］。喻晓雁［15］从鸡矢藤中提取出多种具有抗肿瘤作用的化合物；郭强等［16］研究证实，鸡矢藤苷酸对SCG-7901 胃癌细胞有明显抑制作用。此外，鸡矢藤还具有消炎［17］、镇痛［18］等多种功效。

【本研究切入点】鸡矢藤资源丰富，取材便捷，在岭南地区以消暑除湿功效而闻名。雷州半岛常年光热资源丰富，形成天然的热应激环境，畜禽长期暴露于高温湿热环境中，机体健康易受影响。本研究旨在探索鸡矢藤对动物的药理作用，以期为雷州半岛畜禽的健康养殖提供优质的饲草保健资源。

【拟解决的关键问题】本研究选取鸡矢藤植株地上部分为试验材料，通过阴干方式使其干燥，用粉碎机粉碎，采用乙醇提取法获得其提取物，研究并评价其体外抑菌活性及对试验小鼠的抗炎和镇痛效果，为进一步发掘鸡矢藤的新用途、拓宽其应用领域提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1鸡矢藤 供试鸡矢藤（地上部分），2020年11 月采摘于广东海洋大学校园内（21° 09' N、110° 18' E），经吴钿教授鉴定。本研究试验于广东海洋大学滨海农业学院动物医学临床实验室完成。

1.1.2试验菌种 革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Esherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）；革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。各菌种由广东海洋大学滨海农业学院动物医学微生物实验室提供。

1.1.3试验动物 健康昆明小鼠150 只，体重18～22 g，雌雄各半，购自广东省医学实验动物中心，适应性饲养1 周后进行试验。

1.1.4主要试剂 分析纯试剂：浓硫酸、三氯化铁溶液、冰醋酸、浓盐酸、镁粉等；化学纯试剂：碘化汞钾、5%硫酸溶液、1%铁氰化钾溶液、40%乙醇、三氯化铁-铁氰化钾、10%盐酸溶液、2%盐酸溶液、氯仿、1%三氯化铁溶液、1%氢氧化钠溶液、1%角叉莱胶、二甲苯等；其他试剂：M-H 营养琼脂、LB 肉汤、阿司匹林溶液。

1.1.5主要仪器设备 HK-860W 水冷式中药粉碎机（广州市旭朗机械设备有限公司）、SY-CJ-2FD 双人单面净化工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、LDZF-50KB 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、SHZ-Ⅱ循环水多用真空泵（河南巩义市英峪予华仪器厂）、RE-52 旋转蒸发仪（上海沪西仪器厂）、LRH-150B 生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）等。

1.2 试验方法

1.2.1鸡矢藤药粉及提取液的制备 将鸡矢藤洗净、阴干、粉碎，过孔径425 μm 的筛网，得到鸡矢藤药粉。称取100 g 药粉，用40%乙醇溶液浸提24 h，经6 层纱布过滤，得到滤液和滤渣；将滤渣按上述方法再次浸提，合并滤液，抽滤，浓缩，得到原生药量为1 g/mL 的鸡矢藤乙醇提取液，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2鸡矢藤乙醇提取液化学成分分析 采用颜色反应和沉淀反应，初步分析鸡矢藤乙醇提取液中是否含有生物碱、黄酮类、环烯醚萜类化合物、蛋白质、有机酸、酚类、鞣质、甾体类等化学成分［19-20］。

1.2.3鸡矢藤乙醇提取液体外抑菌试验（1）药敏试验：将4 种供试菌分别接种于M-H 营养琼脂平板上活化。通过麦氏比浊法，将菌液配成浓度为1.5×108CFU/mL 的菌悬液。采用滤纸扩散法进行体外药敏试验［21］。将直径为6 mm 的药敏纸片浸渍于提取液中，充分吸收药液后取出，烘干，贴于涂有菌悬液的平板中心位置。每种供试菌重复3 个平板试验。以生理盐水纸片作为对照，所有平板均置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，通过十字交叉法用游标卡尺测量并记录抑菌圈大小，比较抑菌效果。

（2）最小抑菌浓度（MIC）测定：采用二倍稀释法检测鸡矢藤提取液的MIC［22］。取8 支无菌试管（编号为1～8），1～6 号试管分别加入1 000 μL 菌悬液，之后1 号试管再加入1 000 μL药液，通过二倍稀释法使1～6 号试管的药物浓度依次为500、250、125、62.50、31.25、15.625 mg/mL；7 号试管仅加入1 000 μL 菌液作为阳性对照，8 号试管加入1 000 μL 药液作为阴性对照。所有试管密封置于培养箱中培养24 h 后，观察试管内菌液的浑浊度。

1.2.4鸡矢藤 乙醇提取液对小鼠的抗炎作用研究（1）二甲苯致小鼠耳廓肿胀：取50 只小鼠，称重，随机分为5 组，每组10 只，分别为空白对照（10 mL/kg 蒸馏水），阳性对照（0.2 g/kg阿司匹林），鸡矢藤乙醇提取液高、中、低剂量（10、5、2.5 g/kg）处理。每天灌胃1 次，连续灌胃5 d，最后一次给药30 min 后，于每只小鼠右耳正反面均涂抹二甲苯0.05 mL 致炎，左耳廓作为耳肿胀的空白对照，致炎1 h 后处死小鼠，沿耳廓线剪下双耳，将双耳廓重叠，用直径8 mm 打孔器打孔取下耳片，分别称重，以左右耳片质量差值表示肿胀度，按照下述公式计算小鼠耳廓肿胀度以及抑制率。

（2）角叉莱胶致小鼠足跖肿胀：取50 只小鼠，分组和给药方案同1.2.4（1）。每天灌胃1 次，连续灌胃4 d，第5 天向每只小鼠右后足足垫皮下注射1%角叉莱胶20 μL，致炎后再给各处理小鼠灌胃1 次相应药物，次日处死小鼠，剪取双脚后精确称量，以左右后足质量差值表示肿胀度，按照下述公式计算小鼠足跖肿胀度以及抑制率。

1.2.5鸡矢藤乙醇提取液对小鼠的镇痛作用研究 取50 只小鼠，分组和给药方案同1.2.4（1）。每天灌胃1 次，连续灌胃5 d，最后一次灌药1 h 后向每只小鼠腹腔处注射0.6%醋酸溶液0.01 mL/g［19］。观察15 min 内各小鼠发生首次扭体的时间和扭体次数。小鼠出现腹部向内凹、后肢伸展、臀部抬高等现象时，即为出现1 次扭体反应。统计各处理小鼠出现的痛阈值和15 min 内出现的总扭体数。

1.3 数据分析

采用SPSS21.0 软件处理数据，计算各处理数据的平均值和标准差；采用单因素方差分析的方法，比较不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 鸡矢藤乙醇提取液的主要化学成分

根据显色反应结果（表1）可见，鸡矢藤乙醇提取液中含有 氨基酸、多肽或蛋白质类、酚类、鞣质类、黄酮类、香豆精、萜类内酯类化合物等化学成分，均为植物提取物中常见的活性天然产物，具有抗氧化、镇痛、抗菌、抗肿瘤等多种功效；有机酸类pH 值介于9～10 之间。

表1 鸡矢藤乙醇提取液的化学成分检测结果Table 1 Detection results of chemical components in ethanol extract from Paederia scandens

2.2 鸡矢藤乙醇提取液的体外抑菌效果

2.2.1药敏试验结果 接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的平皿上细菌散乱生长，未出现抑菌圈；而接种蜡状芽孢杆菌的平皿上，药敏纸片周围无菌落生长，抑菌圈平均直径为8.55 mm。由此可见，鸡矢藤乙醇提取液能够抑制蜡状芽孢杆菌的生长，而其他3 种供试菌则对药液不敏感（表2）。

表2 鸡矢藤乙醇提取物的体外药敏试验结果Table 2 Results of in vitro drug sensitivity test of ethanol extract from Paederia scandens

2.2.2MIC 测定结果 在MIC 测定结果中，仅500 mg/mL 药液和阳性对照菌液澄清透明，无肉眼可见悬浮物，其余试管液体浑浊，表明鸡矢藤乙醇提取物在500 mg/mL 浓度下能够抑制蜡状芽孢杆菌的生长繁殖；在250、125、62.50、31.25、15.625 mg/mL 浓度下均无抑制作用（表3）。因此鸡矢藤乙醇提物对蜡状芽孢杆菌的MIC 为500 mg/mL。

表3 鸡矢藤提取液对蜡状芽孢杆菌的MICTable 3 MIC of the Paederia scandens extract against Bacillus cereus

2.3 鸡矢藤乙醇提取液的抗炎作用

2.3.1对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的抑制作用 鸡矢藤乙醇提取液高、中剂量处理能够有效抑制二甲苯引起的小鼠耳廓急性肿胀，与空白对照相比差异极显著。高、中、低剂量处理对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀的抑制率分别为55.00%、30.93%、1.57%，以高剂量处理的抑制作用最明显；阳性对照处理的抑制率为69.29%（表4）。可见，一定浓度的鸡矢藤乙醇提取液对二甲苯致小鼠耳廓炎症反应具有缓解作用。

表4 不同浓度鸡矢藤乙醇提取液对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的抑制作用Table 4 Inhibitory effect of ethanol extract from Paederia scandens at different concentrations on xylene-induced ear swelling in mice

2.3.2对角叉莱胶致小鼠足跖肿胀的抑制作用 鸡矢藤乙醇提取液高、中剂量处理能够有效抑制角叉莱胶引起的小鼠足跖肿胀，与空白对照相比差异极显著。高、中、低剂量处理对角叉莱胶引起的小鼠足跖肿胀抑制率分别为58.26%、49.74%、5.22%，以高剂量处理抑制作用最明显；阳性对照处理的抑制率为63.48%（表5）。可见，一定浓度的鸡矢藤乙醇提取液对角叉莱胶致小鼠足跖炎症反应具有缓解作用。

表5 不同浓度鸡矢藤乙醇提取液对角叉莱胶致小鼠足跖肿胀的抑制作用Table 5 Inhibitory effect of ethanol extract from Paederia scandens at different concentrations on carrageenan-induced foot swelling in mice

2.4 鸡 矢藤乙醇提取液对冰醋酸致小鼠疼痛的镇痛效果

与空白对照相比，鸡矢藤乙醇提取液高、中剂量处理的小鼠首次出现扭体反应的潜伏期差异极显著；低剂量处理则差异显著。各处理15 min内出现的扭体反应总次数与空白对照相比较，差异均达极显著（表6），表明一定浓度的鸡矢藤乙醇提取液能够缓解致痛小鼠的疼痛反应。

表6 不同浓度鸡矢藤乙醇提取液对冰醋酸致小鼠疼痛的镇痛效果Table 6 Analgesic effect of ethanol extract of Paederia scandens at different concentrations on pain induced by glacial acetic acid in mice

3 讨论

3.1 鸡矢藤乙醇提取液化学成分

本研究通过显色反应对鸡矢藤乙醇提取液的化学成分进行初步分析，发现其含有丰富的 黄酮类、香豆精、萜类等多种成分，与马养民等［23］通过系统预试法和单项预试法所得到的结果相符。张书霞［24］分析发现鸡矢藤茎、叶富含抗坏血酸、膳食纤维、铁、铜、钙、镁等，以及谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等18 种氨基酸。张晓峰等［25］证实鸡矢藤提取物能够降低糖尿病小鼠的血糖。可见，无论从营养保健还是饲料添加剂的角度来看，鸡矢藤均具有广阔的发展前景。本研究初步确定鸡矢藤乙醇提取液可能存在的化学成分，为鸡矢藤乙醇提取液抗炎镇痛活性成分的提取、分离、鉴定、纯化和筛选工艺提供参考。

3.2 鸡矢藤乙醇提取液体外抑菌效果

本研究制得的鸡矢藤乙醇提取物对蜡状芽孢杆菌有一定抑制作用，而对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌未见明显抑制作用。这与王珺［22］、曾志红等［26］的结果不一致，但与廖建良等［27］、陈忠等［28］试验结果相似，这可能与药液预处理方法、试验条件等不同有关。鸡矢藤乙醇提取物对蜡状芽孢杆菌的MIC 为500 mg/mL。萧栋等［29］用嫩鸡矢藤提取液对金黄色葡萄球菌的MIC 为625 mg/mL，老鸡矢藤提取液的MIC 甚至更弱，表明植株的生长阶段、采摘季节、取样部位均有可能对其化学成分种类、含量及抑菌活性产生影响。

3.3 鸡矢藤乙醇提取液抗炎作用

二甲苯致小鼠耳廓肿胀法和角叉莱胶致小鼠足跖肿胀法是急性炎症试验中常用的动物模型［30］，其主要机理是通过化学刺激剂使机体局部毛细血管扩张、通透性增加，导致出现局部充血、水肿和渗出等病理现象［30-32］。本试验结果显示，鸡矢藤乙醇提取液高、中剂量处理对2 种炎症小鼠模型均具有较好的抑制作用，提示一定剂量的鸡矢藤乙醇提取液对致炎小鼠具有显著抗炎作用。王昶等［33］研究发现，鸡矢藤水煎液抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，降低由醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性，表明鸡矢藤水煎液和乙醇提取液均具有一定抗炎作用，但同一浓度下，鸡矢藤乙醇提取液对小鼠耳廓肿胀度的抑制程度较高，这提示同一种植物采用不同提取剂提取，其提取液中含有的抗炎成分与含量有所不同。

3.4 鸡矢藤乙醇提取液镇痛作用

扭体法是试验常用的外周性疼痛模型，是筛选非甾体抗炎药镇痛药物的简便方法。本试验结果表明，鸡矢藤乙醇提取液各剂量处理均能延长小鼠首次出现扭体反应的时间和减少15 min 内小鼠的总扭体次数，表明鸡矢藤乙醇提取液对痛觉具有显著抑制作用。陈宇峰［18］研究表明，鸡矢藤提取物中含有的各种糖类和环烯醚萜苷类物质在浓度为800 mg/mL 时镇痛效果明显。目前鸡矢藤多用于人结肠炎等消化道疾病的治疗，缓解部分疾病引起的疼痛症状［34］，但尚无用于我国兽医行业的报道。本试验结果可为鸡矢藤制品应用于病畜临床上的抗炎镇痛提供参考。

4 结论

本研究通过化学成分预试法初步判定鸡矢藤乙醇提取液中含有氨基酸、多肽或蛋白类、酚类、鞣质类、黄酮类、香豆精、萜类内酯类化合物等多种活性物质，具有潜在的抗氧化、镇痛、抗肿瘤、免疫增强等药理学功效；但抗菌谱窄，在4 种供试菌中，鸡矢藤乙醇提取液仅对蜡状芽孢杆菌生长具有一定的抑制活性，抑菌圈直径为8.55 mm，MIC 为500 mg/mL；分别以5、10 g/kg剂量连续灌胃，能够显著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀和角叉莱胶引起的小鼠足跖肿胀，抑制率为55.00%和58.26%，且能显著延长冰醋酸引起的小鼠首次出现扭体反应的时间，减少小鼠扭体反应次数。可见，一定剂量的鸡矢藤乙醇提取液对致炎和致痛小鼠模型具有显著的抗炎和镇痛效果。鸡矢藤有望作为雷州半岛优质饲草资源或饲料添加剂应用于畜禽养殖行业。