建昌帮附子在甘草附子汤中单酯型生物碱含量比较研究*

苏 慧

(江西中医药高等专科学校工程中心,江西 抚州 344000)

附子，又名乌头或附片，为毛茛科、乌头属植物多年生草本子根的加工品。附子属温里药，为中药“回阳救逆第一品”，临床上广泛用于阳虚寒凝证，但生附子有毒，因此临床上通常采用加工炮制减毒后的附子[1]。甘草附子汤源自《伤寒杂病论》，又名四物附子汤，由炙甘草、黑顺片、白术和桂枝4味中药组成，是治疗风湿兼阳虚证的代表方剂之一[2]。“建昌帮”属于“江西药帮”，饮片炮制的工具、辅料、工艺等独具本帮传统风格，采用煨制、蒸制、炒制及烤制法将附子加工成煨附子、淡附子、阴附子和阳附子，适应各种临床需要，盛誉业界[3，4]。

附子中化学成分主要为生物碱类，现从乌头属生物碱中分离出来的已知化学结构主要是二萜类生物碱，其中单双酯型生物碱为当前研究最多的一类生物碱[5]。《中华人民共和国药典》[6]以乌头碱新、乌头碱、次乌头碱3个双酯型生物碱总量评价附子毒性，以苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱3个单酯型生物碱总量评价其有效性。现代研究多集中于甘草附子汤中化学成分及临床应用的研究，对不同附子炮制品规格在复方汤剂生物碱含量差异的研究未见报道，但附子不同炮制品规格与临床疗效密切相关，临床上可合理炮制削减附子毒性来满足临床需求。

实验选取建昌帮附子(煨附子、淡附子、阴附子、阳附子)及临床上使用最多的黑顺片为研究对象，参照《伤寒论》的煎煮方法，分别制备甘草附子汤，以单酯型生物碱总量为评价指标，对建昌帮附子及黑顺片在甘草附子汤中单酯型生物碱含量进行了比较，从其有效成分含量的角度研究附子不同炮制品规格对甘草附子汤的影响，为甘草附子汤的临床用药提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent1260 Ⅱ型高效液相色谱仪(UV检测器，安捷伦科技有限公司)，PWN124型万分之一分析天平(奥克斯仪器有限公司)，Smart-N15UV型超纯水机[美国密理博(Millipore)有限公司]，Strike300型旋转蒸发仪(上海亚荣仪器有限公司)。

1.2 试剂 除乙腈为色谱纯试剂(TEDIA)，其余试剂均为分析纯；对照品：苯甲酰新乌头碱(MUST21022704)、苯甲酰次乌头碱(MUST21031111)、苯甲酰乌头碱(MUST22042014)纯度≥98%，购自曼斯特(成都)生物科技有限公司；黑顺片购于四川江油饮片厂，炙甘草购于江西德惠中药饮片有限公司，桂枝购于江西彭氏国药堂饮片有限公司，白术购于江西同善堂中药饮片有限公司；建昌帮煨附子、淡附子、阴附子、阳附子由江西中医药高等专科学校中药炮制团队负责制备。

2 方法与结果

2.1 成品外观性状比较 抽取建昌帮附子与黑顺片，于自然光下观察其成品外观性状，结果显示，煨附子：呈灰棕色半透明，不规则卵圆形薄中片；阴附子：呈棕黄色半透明，不规则卵圆形薄片；阳附子：呈白黄色不规则卵圆形厚片，表面不平整，断面鼓起；淡附子：呈灰白色不规则卵圆形极薄片；黑顺片：外皮黑褐色。见图1。

A煨附子；B阴附子；C阳附子；D淡附子；E黑顺片图1 建昌帮附子和黑顺片外观性状图

2.2 对照品溶液的制备 精密称取苯甲酰新乌头碱(Benzoylmesaconine，BM)、苯甲酰次乌头碱(Benzoylhypaconine，BH)对照品1 mg，分别用0.05%盐酸-甲醇制成质量浓度为1 mg/mL的单一成分的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 甘草附子汤煎剂的制备参考《伤寒论》，分别称取5份(甘草6 g，桂枝12 g，白术6 g)，其中再分别加入6 g样品，依次为煨附子、阴附子、阳附子、淡附子、黑顺片，加10倍蒸馏水浸泡30 min，微沸提取2次，提取时间分别为60 min和40 min，合并提取液后，双层纱布过滤，将过滤液转移至容量瓶中并定容至250 mL，精密量取100 mL旋转蒸干，残渣用甲醇8 mL、氨水8 mL、三氯甲烷40 mL混合液溶解，加热回流2 h，放冷滤过。滤液60 ℃水浴蒸干，移至10 mL容量瓶中用0.05%盐酸-甲醇溶解，进样前提取液用微孔滤膜过滤。

2.4 阴性供试品溶液的制备 称取甘草6 g，桂枝12 g，白术6 g，按照2.3项下制备，即得阴性供试品溶液。

2.5 高效液相色谱法工作条件 检测波长235 nm；Agilent C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：20 mmoL/L乙酸铵，流动相B：乙腈∶甲醇(1∶1)；洗脱程序：0～10 min，95%～80%A；10～20 min，80%～70%A；20～35 min，70%～55%A。柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.6 色谱分析 吸取混合BM、BH的对照品溶液、甘草附子汤全方煎液(煨附子、阴附子、阳附子、淡附子、黑顺片)、阴性供试品溶液，色谱分析结果见图2。

A阴性供试品；B煨附子；C阴附子；D阳附子；E黑顺片；F淡附片；G 1:BM对照品、2:BH对照品图2 甘草附子汤高效液相色谱图

2.7 方法学验证

2.7.1 线性关系 用0.05%盐酸-甲醇稀释，得一系列浓度BM、BH对照品溶液，根据峰面积积分和对应浓度的XY轴数据，得BM在2.5～110.0 μg/mL浓度范围内标准曲线回归方程：Y=7.2343X+3.9492，r=0.9999；BH在2.0～15.0 μg/mL浓度范围内标准曲线回归方程；Y=15.187X+1.1457，r=0.9998。数据显示，BM、BH对应浓度和峰面积积分呈良好的线性关系。

2.7.2 精密度 吸取10 μL BM、BH对照品溶液，连续进样6针，测得BM峰面积RSD为0.79%，出峰时间RSD为0.04%；BH峰面积RSD为0.36%，出峰时间RSD为0.82%。结果表明，方法精密度良好。

2.7.3 重复性 制备阴附子全方煎液6份，结果测得BM的分离时间RSD为0.07%，峰面积RSD为1.19%；BH的分离时间RSD为0.04%，峰面积RSD为2.77%。表明该方法重复性良好。

2.7.4 稳定性 取阴附子全方煎液，室温条件下于0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果测得BM的分离时间RSD为0.06%，峰面积RSD为2.31%；BH的分离时间RSD为0.05%，峰面积RSD为2.58%。表明阴附子全方煎液在24 h内稳定。

2.7.5 加样回收率实验 取已知含量的阴附子供试品液，分别加入适量的BM、BH对照品溶液，平行操作3次，进行加样后的提取和回收。各组分的回收率见表1，BM的加样回收率在99.41%～103.18%，BH的加样回收率在102.53%～102.94%，说明该方法较为可靠。

表1 阴附子供试品液中BM、BH加样回收数据

2.7.6 样品含量测定 分别精密称取建昌帮附子(煨附子、阳附子、淡附子、阴附子)和黑顺片，各平行制备甘草附子汤全方煎液3份，测定煎煮液中BM、BH含量，见表2。

表2 甘草附子汤中单酯型生物碱含量测定结果

3 讨论

大多数生物碱是以盐的形式存在于中药中，生物碱盐溶于水且不溶于有机试剂，考虑甘草附子汤蒸发干后需用有机试剂溶解，所以实验加热回流中加入氨水使其转为游离态生物碱，方便测定甘草附子汤中单酯型生物碱。盐酸可以抑制单酯型生物碱水解，所以BM、BH对照品溶液溶剂选择加入0.05%盐酸。

分析甘草附子汤单酯型生物碱时，分别考察了有机相为甲醇、乙腈及二者混合3种流动相，结果显示，乙腈∶甲醇(1∶1)分离效果较好。因甘草附子汤单酯型生物碱为弱碱性样品，考虑在水相中加入乙酸铵，增加单酯型生物碱在柱子中分析的保留时间。结果显示，水相加入20 mmoL/L乙酸铵后，谱图分离效果明显改善，且峰分布均匀，故选择乙腈∶甲醇(1∶1)-20 mmoL/L乙酸铵为流动相。

《中华人民共和国药典》采用3个单酯型生物碱总量评价其附子有效性，双酯型生物碱不耐高温，在附子汤中双酯型生物碱可转化为单酯型生物碱。因此实验以单酯型生物碱总量为评价指标，对建昌帮附子及黑顺片在甘草附子汤中单酯型生物碱含量进行了比较研究，但苯甲酰乌头碱在检测中含量较低，未被检测到，所以并未对苯甲酰乌头碱进行含量测定。结果显示，不同附子炮制方法会影响其在甘草附子汤中的单酯型生物碱成分含量，还会影响附子成品外观和颜色，在5种炮制品甘草附子汤全方煎液中，采用煨制法制备的煨附子全方煎液单酯型生物碱成分含量最高，采用胆水浸泡后硫熏制备的黑顺片全方煎液单酯型生物碱成分含量最低，符合建昌帮药帮炮制附子的目的，表明建昌帮附子替代甘草附子汤中黑顺片的可行性。