金线莲茎腐病致病菌的分离及其拮抗菌的筛选

路梅， 刘建峰， 郑熊飞， 刘永立， 胡海涛*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004； 2.武义县俞源乡人民政府，浙江 金华 321200；3.浙江大学 新农村发展研究院，浙江 杭州 310058)

金线莲(Anoectochilusroxburghii)系兰科开唇兰属名贵草本药材，又名金线兰、金丝草、金不换等。金线莲具有很高的药用价值，在民间素有“药王”“乌人参”“金草”“神药”等美称[1]。金线莲种子自然萌发率很低，对生长环境要求高，加之人类过度采挖，致使野生资源濒临灭绝，导致金线莲药源供需矛盾非常突出[2]。人工栽培是解决金线莲供需紧张的唯一途径，但是金线莲人工栽培过程中易感染病虫害，影响其产量和品质。金线莲茎腐病是金线莲人工栽培中一种主要病害，该病原菌可以从金线莲的根茎、根毛和表皮入侵到其茎基部，对不同生长时期的金线莲皆可造成不同程度的病害，发病时植株茎部先出现黄褐色水渍状的病斑，扩大到能绕着茎部一圈，发病部分腐烂成线状[3]。

金线莲茎腐病对金线莲危害极大，且发生普遍，严重制约了金线莲产业的健康发展。目前，金线莲茎腐病主要采用化学农药防控，但该病原菌在金线莲不同生长期皆可造成病害，喷施农药时间点很难把控，防治效果不理想，而且也易导致农药残留和中药的食用安全[4-5]。有益微生物介导的生物防治具有安全、持久、有效和对人畜无害等特点，已成为植物病害防治的重要方向[6-7]。筛选有益菌防治植物病害报道已有很多[8-10]，而关于金线莲茎腐病病原拮抗菌筛选鉴定的研究鲜见报道。本研究采用平板对峙法对3种商业化的生防菌和1株从百合鳞片中分离得到的非致病性尖孢镰刀菌进行筛选，以期获得具有高效拮抗金线莲茎腐病病原菌的生防菌株，为金线莲茎腐病的生物防治提供菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

金线莲正常植株为本实验室快繁栽培的尖叶金线莲品种，患茎腐病植株取自金华市农业科学院种植基地发病的尖叶金线莲。拮抗实验的供试菌株为从哈茨木霉、放线菌、绿色木霉等商品化的生防菌中分离纯化获得的菌株，所有真菌菌种均接种在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)试管斜面上于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基:马铃薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，琼脂15～20 g·L-1。

1.2 金线莲茎腐病致病菌的分离与纯化

本实验采用组织分离法进行金线莲茎腐病致病菌的分离。取金线莲茎腐病患病植株，先用清水洗净表面杂质，再放入75%乙醇溶液对组织表面消毒1 min，然后用0.1% HgCl2消毒5 min，最后无菌水清洗3遍，用无菌滤纸吸干表面水分。切取茎部的病健交界处组织，置于PDA上，在28 ℃恒温培养箱中培养，当培养基上出现菌落时，用无菌接种环挑取菌落边缘的菌丝转新于新的PDA培养基上继续培养，获得初步纯化培养的菌落。将纯培养后的菌株，接种于PDA试管斜面培养好后，在4 ℃冰箱中保存。

1.3 金线莲茎腐病致病菌的形态学鉴定及致病性检测

将纯化的致病菌接种于PDA培养基上进行培养，培养3 d后，观察菌落形态以及用无菌接种环挑取菌落镜检，观察菌丝、孢子形态。

致病性的检测采用针刺接种法。选取健康金线莲的同一茎位茎段，用微量加样枪的针头刺破表皮，于针刺点上接种直径为2 mm的疑似病原菌的菌丝块，同时接种同样直径的空白培养基为对照。每个处理各接种20株植株，接种处理完后共同置于28 ℃环境中，控制好温湿度，保证发病条件，3 d后观察且记录发病情况。

1.4 金线莲茎腐病致病菌的分子鉴定

采用真菌全基因组DNA提取试剂盒提取分离致病菌的DNA，以真菌ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对菌株的DNA进行扩增。PCR反应体系41 μL，其组分如下：4 μL模板DNA，20 μL 10×KOD Buffer，8 μL dNTP，1 μL KOD聚合酶，引物ITS1和ITS4各4 μL。扩增条件：94 ℃，4 min预变性；98 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，35次循环；68 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反应结束后，取5 μL扩增的产物，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物送到杭州尚亚生物技术服务有限公司进行基因测序。获得基因序列后，对菌株的rDNA-ITS序列在GenBank数据库中与已知序列进行对比，并进行同源性分析。结合菌株的形态学观察以及致病性检测，最后确定致病菌的种类。

1.5 金线莲茎腐病致病菌拮抗菌的筛选

采用对峙实验法筛选对金线莲茎腐病的致病菌有抑制作用的拮抗菌株，即在距离平板中央30 mm处接种致病菌菌丝块，同样在距离平板中央30 mm的致病菌对侧处接种供试菌株(哈茨木霉、放线菌和绿色木霉，对照组接种无菌的PDA培养基)，每个实验分别设置3个平行组，观察是否有抑菌作用以及强弱。在PDA平板上分别测量空白对照组的致病菌菌落直径和实验组的致病菌菌落直径。测量到的菌落直径大小，参照以下公式计算抑菌率。抑菌率=(对照菌落直径-实验菌落直径)/对照菌落直径×100%。

2 结果与分析

2.1 病害症状的调查

调查发现金线莲茎腐病是一种易在夏季高温高湿的环境中发生的金线莲病害。金线莲茎腐病症状为茎秆基部或中部呈水渍状的病斑，后变黄干枯缢缩成褐腐烂线状(图1箭头)，基部叶片变黄化、萎蔫下垂、变褐等症状，严重的开始脱落、皱缩，最后整株黄化枯萎。此病是土壤传染性的病害，其程度和土壤中可侵染的病原菌量密切相关，致病菌也可通过肥料、浇水等途径传播。

图1 金线莲患病植株和健康植株

2.2 金线莲茎腐病致病菌的鉴定

2.2.1 致病菌形态学观察

在PDA平板培养基上培养，观察其菌落外貌，致病菌在平板上长出很多棉絮状的菌丝，且能在培养基中分泌出紫色的物质(图2中A)。镜检显示，菌丝具有隔膜及分枝；小型分生孢子数量较多，呈卵形、长圆形或肾形，无色透明，大小为(4.5～10.6)μm×(2.2～3.3)μm；大型分生孢子数量较少，呈镰刀状(图2中C)，大小为(20.5～42.3)μm×(3.0～4.8)μm，多具3个隔膜，顶细胞渐尖或呈钝型；厚垣孢子部分由大孢子部分细胞膨大形成，部分在菌丝侧枝长出，壁光滑或有突起，多呈球形，绝大多数无色，少数为褐色，初步鉴定实验分离出的内生菌符合尖孢镰刀菌的特征。

A—致病菌的菌落特征；B—致病菌的菌丝；C—致病菌的镰刀状分生孢子和厚垣孢子。

2.2.2 致病菌致病性检测

在人工回归接种致病菌第5 d后，金线莲健康的植株开始发病，表现出明显的茎腐病症状。取致病菌侵染的金线莲植株进行致病菌的再分离，得到与接种菌株具有相同形态学特征的致病菌(图3)。

图3 致病性检测

2.2.3 致病菌分子学鉴定

用真菌共用引物进行茎腐病致病菌的rDNA-ITS片段PCR，扩增出的特异性单一条带在523 bp左右(图4)，产物测序后获得该致病菌的基因序列。用GenBank已知的DNA序列与致病菌的rDNA-ITS序列进行同源性比较，数据表明，与致病菌同源性较高的菌株是尖孢镰刀菌(F.oxysporumSchl.)，同源性高达98%。据此，结合形态学特征，确定引起金线莲茎腐病的致病菌为尖孢镰刀菌。

图4 金线莲茎腐病致病菌的rDNA-ITS序列

2.3 拮抗菌的筛选

通过对峙实验法筛选到3种有良好抑菌作用的拮抗菌，分别是哈茨木霉、绿色木霉、放线菌。实验结果如下图所示(图5～7)，可以看出3种拮抗菌对金线莲茎腐病致病菌尖孢镰刀菌的萌发和生长具有抑制作用，且3种拮抗菌的生长速率显著快于致病菌。实验5 d后，哈茨木霉的抑菌率最高，为66.7%；绿色木霉次之，为63.9%；放线菌的抑菌率为62.5%(表1)。

表1 3种拮抗菌对金线莲茎腐病致病菌的抑菌实验结果

A、B—哈茨木霉与致病菌的对峙实验菌落形态；C—对照，未接种哈茨木霉菌。

3 讨论

尖孢镰刀菌是一种世界性的毁灭性病原真菌，可侵染100多种具有重要价值的作物，引发作物枯萎导致根腐病[11-12]。由镰刀菌枯萎病引起的土传病害正威胁我国香蕉[13]、西瓜[14]、铁皮石斛[15]、百合[16]等多种重要经济作物的生产。本研究从患茎腐病的金线莲茎段中分离得到一株疑似致病菌菌株，通过形态学、分子生物学和致病性检测等方法进行了鉴定。依据镰刀菌分类标准，确定该金线莲茎腐病的致病菌为尖孢镰刀菌(F.oxysporumSchl.)，与赵云青等[3]的结果一致。金线莲整个生长周期均有可能感染茎腐病，且该病病势迅猛，极易在短期内出现大面积倒伏，严重制约其产业发展，生产上防治金线莲茎腐病主要用百菌通、多菌灵等化学农药进行防治，而化学防治必定会带来诸多的问题，例如药剂残留危害人类的健康。因此，寻找到一种绿色环保的防治方法尤为重要，是符合当前人们追求健康生活的理念，而生物防治无疑是最好的选择。

A、B—绿色木霉菌与致病菌的对峙实验菌落形态；C—对照，未接种绿色木霉菌。

A、B—放线菌与致病菌的对峙实验菌落形态；C—对照，未接种放线菌。

抑菌实验结果表明，哈茨木霉、绿色木霉、放线菌都对金线莲茎腐病致病菌都有良好的抑制效果。3种拮抗菌表现出的抑制作用可能与拮抗菌争夺致病菌营养物质或分泌拮抗物质等因素有关，具体原因有待进一步深入研究。生防菌在寄主中稳定定殖是其发挥防病作用的重要前提，也是决定其防病效果的关键因素。由于本文采用的是平板对峙培养法，生防菌在离体条件下的拮抗实验和自然情况下的抑制作用未必存在必然的关系，往往实验室中拮抗菌有明显的抑制效果，但接种到植株的根际土壤后却没有生防作用。本研究是在实验室中开展的，缺乏必要的实际生产防效实验。若经过进一步的实际生产实验验证，3种拮抗菌将有望成为防治金线莲茎腐病第一选择的绿色药剂。这样不仅可以减少化学农药的使用量和使用频率，进一步减低农残，还可以减少种植户的生产成本，在金线莲的实际生产中有巨大的市场前景价值。