过敏性紫癜患儿TLR4、LTB4、SOCS5表达与Th1和Th2的关系*

黄翠影，李 军，张 菂，蔡 花，幺 鑫，王彩芳△

1.河北省唐山市妇幼保健院儿内科，河北唐山 063000；2.开滦总医院麻醉科，河北唐山 063000；3.开滦总医院儿科，河北唐山 063000

过敏性紫癜(HSP)属于系统性血管炎的一种，主要是由免疫复合物介导的出血性疾病[1]。大多数学者认为HSP是由免疫蛋白A介导的免疫复合物沉积在血管壁所诱发的免疫损伤，扩增血管壁的通透性，血液与淋巴液从其中渗出，最终导致体内多部位发生病变[2]。同时，HSP也会受细胞免疫功能紊乱、细胞因子等影响[3]。HSP发病的关键就是感染，而Toll样受体(TLR)则能够对病原相关分子模式进行识别，且在辅助型T细胞1(Th1)/辅助型T细胞2(Th2)免疫应答失衡期间，TLR也会参与其中[4]。而在过敏性炎症迟发阶段，白三烯B4(LTB4)为具有大量表达的炎症介质参与炎性反应过程[5]，细胞因子信号传导抑制蛋白(SOCS)是一类由多种细胞因子诱导产生，对细胞因子信号转导具有抑制作用的负调节因子，SOCS5正向调控Th1分化，负向调控Th2分化[6]，但其与Th1和Th2关系的研究较少，因此本研究通过对HSP患儿的TLR4、LTB4、SOCS5和Th1/Th2表达及关系进行分析，旨在为临床HSP患儿的诊断和治疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究选取2018年6月至2021年6月河北省唐山市妇幼保健院和开滦总医院接诊的86例HSP患儿作为研究组，选取同期河北省唐山市妇幼保健院和开滦总医院体检健康儿童90例作为对照组，回顾性收集病历资料和实验室检查资料。研究组男46例，女40例；年龄3～12岁，平均(8.57±1.65)岁；分型：单纯型20例，混合型66例，根据是否伴有肾损害将混合型HSP患儿分为伴有肾损害组(23例)和未伴有肾损害组(43例)。对照组男51例，女39例；年龄3～12岁，平均(8.51±1.71)岁。两组患儿性别、年龄等一般资料差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)根据《诸福棠实用儿科学(第7版)》[7]儿童HSP诊疗规范，符合HSP的诊断标准且需具备HSP诊疗依据；(2)入组前1个月内未接受相关糖皮质激素治疗；(3)HSP和健康儿童临床资料均齐全。排除标准：(1)临床病历资料不完整；(2)入组前1个月内存在感染史或过敏性疾病史；(3)患儿入组前1个月内接受糖皮质激素或其他免疫制剂的治疗；(4)患儿合并先天性遗传性疾病；(5)患儿合并免疫性疾病、恶性肿瘤或其他慢性疾病；(6)患儿凝血功能异常。本研究经医院伦理委员会审核批准。均与儿童家属取得联系，获得家属知情同意。

1.2方法

1.2.1资料收集 研究组：(1)入院前已经确诊，需要对患儿的病例资料完整收集，并进行核对和检查；(2)入院前未经确诊，于入院时抽取静脉血2 mL，采集血液标本后，将血液在3 h内分离血清，以3 500 r/min离心15 min后取其上清液，并将其置于-20 ℃的环境中保存备检。对照组：收集所有健康儿童体检时临床资料和实验室检查资料。

1.2.2酶联免疫吸附试验(ELISA) 送检测定LTB4和Th1、Th2水平[选取两个代表性指标白细胞介素(IL)-4和γ干扰素(IFN-γ)]采用ELISA测定，试剂盒购自上海邦景实业有限公司，根据说明书进行严格操作。

1.2.3外周血检测 外周血单核细胞：使用肝素钠抗凝管收集所有纳入研究儿童外周静脉血5 mL，将其外周血单核细胞进行分离，应用RNA提取并悬浮，完成后将其置于-80 ℃冰箱，待测TLR4和SOCS5 mRNA水平。采用TLR4和SOCS5分离试剂盒(上海瑞番生物科技)提取所需总RNA，详细步骤按照说明书进行，再使用逆转录试剂盒将cDNA合成PCR引物，以GAPDH作为内参基因，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.4基因检测 SOCS5基因表达：反应体系为每个样品设3个重复，循环条件为95 ℃。反应条件为95 ℃和60 ℃下分别循环30 s、95 ℃下预变性3 min，并将60 ℃的温度下时间延长至30 s退火，并将72 ℃延伸至60 s，共计39个循环。TLR4基因表达检测：反应体系为每个样品设3个重复，循环条件为95 ℃ 5 min，95 ℃和60 ℃下分别循环30 s、72 ℃下循环30 s，共对其进行循环40次，并将60 ℃的温度下时间延长至5 min。

2 结 果

2.1研究组和对照组TLR4、SOCS5 mRNA表达水平比较 研究组TLR4 mRNA和SOCS5 mRNA表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 研究组和对照组TLR4和SOCS5 mRNA表达水平比较

2.2研究组和对照组LTB4、Th1和Th2表达水平比较 研究组LTB4和IL-4表达水平均高于对照组，IFN-γ表达水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 研究组和对照组LTB4、Th1和Th2表达水平比较

2.3不同分型HSP患儿TLR4、SOCS5 mRNA表达水平比较 混合型HSP患儿TLR4 mRNA和SOCS5 mRNA表达水平均高于单纯型HSP患儿，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同分型HSP患儿TLR4、SOCS5 mRNA表达水平比较

2.4不同分型HSP患儿LTB4、Th1和Th2表达水平比较 混合型HSP患儿LTB4和IL-4表达水平均高于单纯型HSP患儿，IFN-γ表达水平低于单纯型HSP患儿，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 不同分型HSP患儿LTB4、Th1和Th2表达水平比较

2.5是否伴有肾损害HSP患儿TLR4、SOCS5 mRNA表达水平比较 HSP混合型组中伴有肾损害患儿TLR4 mRNA和SOCS5 mRNA表达水平均高于未伴有肾损害患儿，差异有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6 是否伴有肾损害HSP患儿TLR4和SOCS5 mRNA表达水平比较

2.6是否伴有肾损害HSP患儿LTB4、Th1和Th2表达水平比较 HSP混合型组中伴有肾损害患儿LTB4和IL-4表达水平均高于未伴有肾损害患儿，IFN-γ表达水平低于未伴有肾损害患儿，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表7。

表7 是否伴有肾损害HSP患儿LTB4、Th1和Th2表达水平比较

2.7TLR4、LTB4和SOCS5表达水平与IFN-γ和IL-4表达水平的相关性 TLR4、LTB4和SOCS5表达水平与IFN-γ均呈负相关(r=-0.920、-0.935、-0.970，P<0.05)；TLR4、LTB4和SOCS5表达水平与IL-4均呈正相关(r=0.991、0.975、0.973，P<0.05)。

2.8TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4对HSP的诊断价值 TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4诊断HSP的ROC曲线下面积(AUC)均在0.750以上，均具有较高的特异度和灵敏度，其中联合检测的AUC为0.977，显著高于各项单独检测，见表8、图1。

表8 TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4对HSP的诊断价值

图1 TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4诊断HSP的ROC曲线

3 讨 论

儿童HSP属于儿科常见疾病，其发病率呈逐年升高趋势，目前临床认为该疾病是由多种因素所作用，并非单一因素所致[8]，发病机制可能为：(1)受环境因素影响，可刺激T淋巴细胞，导致免疫功能发生紊乱，并促使T淋巴细胞不断扩增，最终使得免疫球蛋白A介导广泛白细胞碎裂，形成小血管炎；(2)机体内炎症细胞因子水平的提高；(3)凝血因素也会产生影响，可见机体内小血管存在局部血栓[9]。近几年有学者针对T淋巴细胞亚群展开研究，研究结果却并不统一，但其中关于HSP患儿存在辅助型T细胞(Th)免疫功能紊乱的观点却比较一致[10]。在疾病急性发作期，患儿体内还存在Th1/Th2失衡的情况，在机体免疫反应中，Th是重要的调控/效应细胞，若Th1/Th2失衡，则会导致机体内免疫功能出现失衡的情况，同时在其他因子协同作用下发生免疫性疾病[11]。

IFN-γ是机体Th1分泌的主要细胞因子，在细胞免疫应答反应过程中参与介导，IL-4是由机体Th2分泌的细胞因子，主要在机体体液免疫过程中参与介导[12]。有学者指出，在HSP的发病过程中，机体体液免疫应答过程逐渐增强，通过Th2对抗原的识别功能可以促进B细胞的克隆活化，从而为机体提供抗原和刺激信号，促进机体循环[13]。在本研究中，研究组IL-4表达水平高于对照组，IFN-γ表达水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示HSP患儿体内Th1/Th2紊乱，Th2活化程度过强，体液免疫功能增强。

TLR不仅表达于人体单核巨噬细胞、淋巴细胞及树突细胞等细胞表面，同时也在纤维细胞中有表达，目前已有相关研究指出TLR参与机体的免疫应答过程，与机体炎性反应存在密切关系，并可介导机体炎症和免疫功能紊乱，进而导致机体免疫性疾病的发生[14]。TLR4是机体中最重要的TLR分子之一，本研究发现HSP患儿体内TLR4分子呈高表达，且随着患儿病情的加重和混合病型的出现，TLR4逐渐升高，分析其原因主要为当机体外周血中TLR4高表达时，外源性配体对其产生一定刺激，从而参与疾病的发生，同时该分子可以在机体内识别相关配体后对下游信号通路给予激活，从而调节机体多种细胞因子的合成[15]。此外，本研究发现TLR4与IL-4呈正相关，与IFN-γ呈负相关，推测在Th1和Th2生成过程中，TLR4在机体内的高表达可能参与其调节机制，从而实现对Th1和Th2免疫应答的调控。

而当机体发生免疫反应时，花生四烯酸经酶会产生一定的促炎性反应作用，从而促进LTB4的产生，LTB4在机体的多种疾病和反应过程中均有参与，是对细胞产生强烈效应的一种细胞催化剂[16]。在本研究中，研究组LTB4表达水平高于对照组(P<0.05)，分析原因主要为LTB4可以将机体内参与免疫和炎性反应的细胞进行收集并激活，而该类细胞被激活后会反作用于LTB4的释放，使其在机体内形成放大效应，进而导致机体内发生多种炎性疾病[17]。此外，本研究发现LTB4与IL-4呈正相关，与IFN-γ呈负相关，分析其机制主要为机体内LTB4呈高表达时，体内嗜酸性粒细胞等被激活，将细胞因子的颗粒致敏反应给予提升，同时促进血管内炎性反应，增强患儿局部血管通透性，而IFN-γ表达的降低会在一定程度上对患儿免疫调控功能进行抑制，从而造成Th1/Th2平衡紊乱，进而抑制机体免疫功能和T淋巴细胞的杀伤效用[18]。

SOCS5主要由细胞因子诱导而产生，对细胞因子信号转导具有一定的抑制和调节作用，临床研究以SOCS1、SOCS3更为深入，对于SOCS5的研究较少，但有文献指出SOCS5正向调控Th1分化，负向调控Th2分化，且其主要表达在Th1[19]。在本研究中，研究组SOCS5 mRNA表达水平高于对照组，SOCS5表达水平与IL-4呈正相关，与IFN-γ呈负相关，分析其原因主要为SOCS5参与机体内免疫调节过程，是机体内具有生理调节作用的固有免疫因子，通过对巨噬细胞或树突细胞激活进行负向调控，参与机体调控T细胞分化、成熟和凋亡的过程，主要作用是维持Thl和Th2的稳定，在机体免疫调控中发挥重要作用，其中IL-4可以激活机体内STAT3信号通路，上调SOCS5表达，而干扰IFN-γ信号转导，主要参与调节T淋巴细胞的分化，使其共同参与HSP的发病[20]。此外，本研究还发现TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4诊断HSP的AUC均在0.750以上，均具有较高的特异度和灵敏度，其中联合检测诊断HSP的AUC为0.977，显著高于各项单独检测，推测上述因子均参与患儿的发病过程，且临床进行联合检测的应用价值较高，但具体机制尚未明确，在今后的研究中，可以通过进一步扩大样本量和进行基础研究，分析TLR4 mRNA、LTB4、SOCS5 mRNA、IL-4和IFN-γ在伴有肾损害HSP患儿中的作用机制。

综上所述，HSP患儿TLR4 mRNA、LTB4、SOCS5 mRNA及IL-4均呈高表达，IFN-γ呈低表达，TLR4、LTB4和SOCS5表达水平与IL-4呈正相关，与IFN-γ呈负相关，可以将其作为HSP患儿的诊断和治疗参考依据，值得在临床推广应用。