血清LncRNA MEG3、miR-141表达在类风湿关节炎诊断评估中的价值及与IL-6、TNF-α、RF、CRP的相关性

刘媛媛，李洪春

类风湿关节炎是一种慢性系统性自身免疫性疾病，临床主要表现为手、足小关节等多发性关节炎，可致患者关节疼痛、损伤甚至功能丧失，严重影响患者生活质量[1]。刘振峰等[2]研究表明，骨性关节炎患者软骨组织中长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)表达降低，其降低程度与软骨退化程度升高关系密切。LI等[3]发现，LncRNA MEG3通过靶向调控炎性因子表达，从而在强直性脊柱炎中发挥重要作用。胡玲等[4]研究指出，在骨性关节炎模型大鼠脊髓背角神经细胞中微小RNA-141(miR-141)表达升高，并且其升高与模型小鼠关节疼痛程度呈正相关。WANG等[5]研究报道，在结直肠癌化疗耐药进展中，miR-141与LncRNA MEG3存在一定的调控关系。但关于miR-141与LncRNA MEG3在类风湿关节炎中的作用及关系目前尚不清楚。在类风湿关节炎发生发展过程中，炎性因子介导的炎症反应起着重要作用[6]。白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)为机体重要的炎症反应标志物，三者在类风湿关节炎患者中明显升高，且其升高程度提示疾病活动程度[7-9]。类风湿因子(RF)是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，目前广泛应用于类风湿关节炎的诊断[10-11]。本研究通过检测类风湿关节炎患者和体检健康者血清LncRNA MEG3、miR-141表达及IL-6、TNF-α、RF、CRP水平，探究血清LncRNA MEG3、miR-141表达在类风湿关节炎诊断评估中的价值及与IL-6、TNF-α、RF、CRP的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1月—2021年12月赣榆区人民医院收治的类风湿关节炎40例，其中男4例，女36例；年龄28～59(47.12±9.45)岁；病程0.5～3.2(2.16±0.25)年。①纳入标准：均符合类风湿关节炎的诊断标准[12]；临床资料完整。②排除标准：伴其他自身免疫性疾病、高血压病、糖尿病、感染性疾病、精神疾病及肝、肾功能障碍性疾病者；临床资料欠缺者。另选取同期正常体检的健康者40例作为对照组，其中男5例，女35例；年龄26～60(47.55±8.46)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要试剂及仪器 RNA提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒、逆转录试剂盒均购自赛默飞世尔科技有限公司；IL-6、TNF-α酶联免疫吸附试验试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1样本采集：观察组于来院后第2日采集空腹外周血5 ml，对照组体检时采集空腹外周血5 ml，3000 r/min离心5 min，分离血清，置于-80 ℃环境中保存待检。

1.3.2血清LncRNA MEG3、miR-141表达检测：采用qRT-PCR法检测血清LncRNA MEG3、miR-141表达水平。取血清样本加入RNA提取试剂提取总RNA。逆转录RNA，获得cDNA。行qRT-PCR检测，20 μl反应体系：cDNA 2 μl，Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，上、下游引物各2 μl，DEPC水3.6 μl。将反应体系按如下步骤进行反应：95 ℃ 7 min，1个循环；95 ℃ 15 s，62 ℃ 32 s，73 ℃ 15 s，40个循环。LncRNA MEG3以GAPDH为内参基因，miR-141以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算血清LncRNA MEG3、miR-141相对表达量。qRT-PCR引物序列:LncRNA MEG3 上游引物:5'-GGGCTTCTGGAATGAGCATGCTACTG-3',下游引物:5'-ACATTCGAGGTCCCCTTCCCACGTAGGCATC-3';miR-141 上游引物:5'-GCCTGTAGCTTTTCCTACT-3',下游引物:5'-CACGGCGGTTCGTCGAGT-3';GAPDH 上游引物:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3',下游引物:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3';U6 上游引物:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.3.3血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平检测：采用酶联免疫吸附试验检测2组血清IL-6、TNF-α水平，采用免疫比浊法检测血清RF、CRP水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1血清LncRNA MEG3、miR-141表达水平比较 观察组血清LncRNA MEG3表达水平明显低于对照组，miR-141表达水平明显高于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 2组血清LncRNA MEG3、miR-141表达水平比较

2.2血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平比较 观察组血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均高于对照组(P<0.01)。见表2。

表2 2组血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平比较

2.3血清LncRNA MEG3、miR-141表达与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平的相关性 观察组血清LncRNA MEG3表达与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平呈显著负相关(P<0.01)，血清miR-141表达与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平呈正相关(P<0.01)。见表3。

表3 类风湿关节炎患者血清LncRNA MEG3、miR-141表达与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平的相关性

2.4血清LncRNA MEG3、miR-141对类风湿关节炎的诊断效能 血清LncRNA MEG3诊断类风湿关节炎的曲线下面积为0.812(95%CI：0.733，0.866)，当LncRNA MEG3取最佳截断值0.81时，诊断敏感度为77.00%，特异度为71.30%；血清miR-141诊断类风湿关节炎的曲线下面积为0.834(95%CI：0.786，0.857)，当miR-141取最佳截断值1.82时，诊断敏感度为75.70%，特异度为84.20%；二者联合诊断类风湿关节炎的曲线下面积为0.876(95%CI：0.831，0.912)，诊断敏感度为88.91%，特异度为80.14%。见图1。

图1 血清LncRNA MEG3、miR-141诊断类风湿关节炎的ROC曲线

3 讨论

类风湿关节炎患者多累及手、足、腕、膝关节等部位，出现肿胀、畸形、脱位等症状，若累及其他器官可出现心肌炎、冠状动脉炎、皮肤溃疡、间质性肾炎等表现，严重影响患者的身体健康[13-15]。目前，类风湿关节炎的发生机制不明，马武开等[16]认为，本病发生与T淋巴细胞及巨噬细胞释放大量炎性因子引起骨关节破坏有关。

CHEN等[17]研究发现，LncRNA MEG3通过调控骨关节炎患者软骨细胞增殖、凋亡、细胞外基质降解和炎症反应程度在疾病发生发展过程中起重要作用，其表达水平明显降低。LI等[18]在一项动物实验中指出，LncRNA MEG3可减少肺部感染模型小鼠炎性因子产生。TONG等[19]在高糖诱导的糖尿病视网膜病变模型中发现，通过抑制LncRNA MEG3表达可促进TNF-α、IL-6等炎性因子分泌，加重疾病进程。LI等[20]研究显示，在骨关节炎兔模型中LncRNA MEG3过表达可降低TNF-α、IL-6水平，从而缓解模型兔疼痛和炎症反应程度。TIAN等[21]研究发现，在股骨头坏死模型小鼠骨组织中miR-141呈高表达，当干预其表达使之降低后模型小鼠成骨细胞活性明显改善，提示干预miR-141表达可延缓股骨头坏死疾病进展。

IL-6和TNF-α是类风湿关节炎重要的炎症反应标志物，其水平与疾病程度呈正相关[22-25]。IL-6通过促使胸腺细胞及T细胞分化为细胞毒性T细胞参与类风湿关节炎发病，与本病发生密不可分，还可通过促进B细胞成熟分泌RF抗体，及促进滑膜成纤维细胞增生导致关节受损[26]。TNF-α是类风湿关节炎发病重要的促炎细胞因子，由单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、T细胞、B细胞等分泌，可诱导内皮细胞黏附分子表达，促进白细胞与血管内皮黏附渗透导致局部炎症反应，促进成纤维细胞、内皮细胞及滑膜细胞等细胞生长因子释放，促进胶原降解、骨质破坏及软骨损伤[27]。RF是临床诊断类风湿关节炎最常用的实验室指标，阳性检出率为50%～90%，但在系统性红斑狼疮、系统性硬化病、多发性心肌炎等其他免疫性疾病中常呈阳性，加之某些健康者中也会呈现阳性，故临床医生通常用于类风湿关节炎的辅助诊断，不宜单独应用。CRP是肝脏合成的急性时相反应蛋白，虽然反映类风湿关节炎患者炎症反应程度及病情的效果不是很好，但却可通过检测其阳性表达预测是否为类风湿关节炎所引起的炎症反应，故可作为类风湿关节炎较好的辅助检查指标。本研究显示，观察组血清LncRNA MEG3表达明显低于对照组，血清miR-141表达明显高于对照组，血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平高于对照组，且观察组血清LncRNA MEG3表达与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均呈负相关，血清miR-141表达与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均呈正相关。提示LncRNA MEG3、miR-141可能通过调控上述炎性因子表达水平，影响类风湿关节炎的发生发展进程。

本研究还发现，血清LncRNA MEG3、miR-141联合检测诊断类风湿关节炎的曲线下面积为0.876，敏感度为88.91%，特异度为80.14%，二者联合诊断类风湿关节炎的效能高于单一诊断。提示血清LncRNA MEG3、miR-141联合检测对类风湿关节炎的诊断价值较高。

综上所述，类风湿关节炎患者血清LncRNA MEG3表达降低、miR-141表达升高，且与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平具有显著相关性，二者可能通过调控上述炎性因子表达参与疾病的发生发展进程，且二者联合检测对类风湿关节炎的诊断效能较高。