甘蔗褐条病与梢腐病病原菌快速大量产孢的培养方法

单红丽，李银煳，李婕，王晓燕，张荣跃，李文凤，黄应昆

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远 661699）

0 引言

我国是世界上第三大食糖生产国和消费国，甘蔗是我国重要的糖料经济作物，蔗糖产业在促进边疆地区经济发展、农民增收和乡村振兴中具有重要作用[1]。甘蔗褐条病和梢腐病是为害甘蔗叶部的灾害性真菌病害，广泛分布于世界多个植蔗国家和地区，给当地蔗糖产业带来不同程度的经济损失[2-3]。近年多雨高湿加上感病品种规模化种植，导致甘蔗褐条病和梢腐病在云南、广西蔗区为害成灾，损失严重[4-6]。多数蔗区因防治不及时、不到位，感病品种常使大量蔗茎枯死，甘蔗减产30%～48%，糖分降低2%～4%，经济损失巨大[5-7]。适时监测病菌变异动态、致病力差异和筛选抗病品种是病害防控的基础和关键，而监测病菌变异动态、致病力差异、筛选抗病品种及绿色高效杀菌剂等应用研究，均需要获得大量的病菌分生孢子[8]。如何快速获得足量的分生孢子成为当前甘蔗褐条病和梢腐病理论研究和实践工作中首要解决的问题及技术难点。改进和提高现有甘蔗褐条病和梢腐病病原菌产孢技术体系，有助于深入研究病原菌、精准监测病菌变异动态、高效筛选抗病品种，为病害防控提供基础和技术支撑。为此，我们针对现有培养技术的缺陷与不足，通过实验对比，筛选出甘蔗褐条病与梢腐病病原菌快速大量产孢的培养方法，以满足甘蔗褐条病和梢腐病深入研究与防控的需求。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

本研究所用甘蔗褐条病菌菌株和梢腐病菌菌株均采集自云南省农业科学院甘蔗研究所基地，保存于云南省甘蔗遗传改良重点实验室。

1.1.2 供试试剂

KH2PO4，KNO3，蔗糖，维生素B1，维生素B2，维生素B6，烟酰胺，泛酸钙，维生素C，马铃薯，燕麦片，葡萄糖，琼脂。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离鉴定

采集感染甘蔗梢腐病病叶，采用组织分离法分离病菌，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养，28 ℃培养3 d 后挑取边缘菌丝，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上纯化获得纯化菌株。用真菌基因组DNA 提取试剂盒（上海生工生物股份有限公司）按说明书提取菌丝DNA，用通用引物ITS1/ITS4进行扩增，扩增得到的片段送华大基因公司测序，测序得到的片段在NCBI 数据库进行比对，片段与数据库登录甘蔗梢腐菌菌株序列片段一致性为100%，则确定获得菌株为甘蔗梢腐病病菌。褐条病菌分离鉴定方法同上。

1.2.2 产孢培养基制备

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA 培养基）：取马铃薯200 g，向其中加入适量超纯水，电磁炉上加热30 min，期间不断搅拌，4 层纱布过滤，取滤液，向其中分别加入20 g 葡萄糖，20 g 琼脂粉，加入超纯水定容至1 000 mL，混匀。

马铃薯葡萄糖水培养基（PDB培养基）：取马铃薯200 g，向其中加入适量超纯水，电磁炉上加热30 min，期间不断搅拌，4层纱布过滤，取滤液，向其中加入20 g葡萄糖，加入超纯水定容至1 000 mL，混匀。

甘蔗褐条病菌产孢培养基：取30 g 燕麦片，向其中加入适量超纯水，80 ℃水浴120 min，期间不断搅拌，4层纱布过滤，取滤液，向其中加入17 g琼脂粉，加入超纯水定容至1 000 mL，混匀。

甘蔗梢腐病菌产孢培养基：在盛有100 mL超纯水的容器中分别加入KH2PO41g、KNO31g、蔗糖0.5 g、维生素B1 3 mg、维生素B2 1.5 mg、维生素B6 0.2 mg、烟酰胺10 mg、泛酸钙1mg、维生素C 100 mg，加入超纯水定容至1 000 mL，混匀。

将混匀的培养基分装在250 mL 三角瓶内，121 ℃，105 kPa 高压灭菌20 min，取出冷却至50 ℃，得产孢培养基。

1.2.3 甘蔗褐条病菌产孢条件实验

不同培养基对病原菌产孢的影响：取直径4 mm 褐条病菌菌块，分别接种于PDA 培养基和甘蔗褐条病菌产孢培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中，培养7 d后测量孢子量。

不同光照处理对病原菌产孢的影响：取直径4 mm 褐条病菌菌块，接种于甘蔗褐条病菌产孢培养基上，28 ℃下分别置于24 h连续黑暗、12 h光照12 h黑暗条件下培养7 d后测量孢子量。

去除菌丝处理对病原菌产孢的影响:取直径4 mm 褐条病菌菌块，接种于甘蔗褐条病菌产孢培养基上，待菌落长至直径5 cm 时，在超净工作台中用无菌棉签将菌落的白色气生菌丝除去，以未用无菌棉签除去菌落白色气生菌丝的培养皿为对照，置于28 ℃恒温培养箱中，暗培养7 d后测量孢子量。

1.2.4 甘蔗梢腐病菌产孢条件实验

将纯化培养的甘蔗梢腐病菌菌丝用无菌手术刀刮取后，汇集到已灭菌的梢腐病菌产孢培养基和PDB培养基中，200 r/min，27±2 ℃下振荡培养3 d后测量孢子量。

1.2.5 产孢量测定

甘蔗褐条病菌产孢量测定：在产孢培养基表面倒入适量无菌水，轻磨菌落，洗下分生孢子，用双层无菌纱布过滤后在显微镜下计量分生孢子数。

甘蔗梢腐病菌产孢量测定：将甘蔗梢腐病病菌培养液分装到无菌的50 mL 离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清，收集沉淀，用无菌蒸馏水重悬，即可获得甘蔗梢腐病菌的分生孢子。

2 结果与分析

2.1 甘蔗褐条病菌快速大量产孢的培养

甘蔗褐条病菌培养7 d后，在产孢培养基上能够看见大量灰褐色的分生孢子堆（图1 a），产孢测定发现有大量分生孢子（图1 c）；在PDA 培养基上菌落白色絮状菌丝（图1 b），未发现分生孢子，培养15 d 后镜检观察到少量分生孢子（图1 d）。

图1 甘蔗褐条病菌菌落形态及分生孢子Fig.1 Colony and conidia of sugarcane brown stripe pathogen

甘蔗褐条病菌在24 h 连续黑暗条件下产孢量最大，达到3×102个/mL，12 h 光照12 h 黑暗条件下则不利于产孢，产孢量仅为3×101个/mL；去除菌丝处理后产孢量增大，达到4×102个/mL，而未用无菌棉签处理的对照产孢量较少，仅为3×101个/mL。

2.2 甘蔗梢腐病菌快速大量产孢的培养

甘蔗梢腐病菌在PDA 培养基上纯化培养所得菌落形态如图2 a，为白色絮状菌丝，取菌丝在梢腐病菌产孢培养基上振荡培养3 d 后，在10（目镜）×40（物镜）下显微镜下观察20～40 个视野，平均每个视野可观察到30～50 个分生孢子（图2 b），而在PDB培养基上振荡培养3 d 后，平均每个视野仅可观察到5～8 个分生孢子。

图2 甘蔗梢腐病菌菌落形态及分生孢子Fig.2 Colony and conidia of sugarcane pokkah boeng pathogen

3 讨论与结论

甘蔗褐条病病原菌属无性菌类半知菌亚门丛梗孢目平脐孺孢属。国内外对甘蔗褐条病菌培养所用的培养基多为PDA 培养基[8-9]，但PDA 培养基培养技术存在病菌生长速度缓慢，产孢时间长，易杂菌污染，不产孢或产孢数量少等问题，不但阻碍了甘蔗褐条病病原菌生活史和病害发生规律的研究，而且不利于开展对抗病品种进行鉴定筛选等相关研究工作，已成为制约甘蔗褐条病研究的瓶颈。本研究通过对褐条病菌大量产孢培养方法的研究，发现取直径4 mm褐条病菌菌块，接种于甘蔗褐条病菌产孢培养基上，待菌落长至直径5 cm时，在超净工作台中用无菌棉签将菌落的白色气生菌丝除去，将病原菌置于24 h 连续黑暗条件下培养7 d可获得大量分生孢子。相比PDA 传统产孢培养方法，本方法的病原菌产孢速率快1 倍以上，产孢量增加10 倍以上，有效地解决了产孢少、产孢慢的技术难题，且本方法的培养方法步骤简单，操作方便，污染率低，可以促进甘蔗褐条病菌快速高效产孢，为甘蔗褐条病病原菌生活史、病害发生规律、筛选抗甘蔗梢腐病优良品种和防治方法等相关研究奠定了基础。

甘蔗梢腐病是由多种镰刀菌引起的一种重要的世界性甘蔗真菌病害。镰刀菌鉴定指南[10]中通常用康乃馨叶片水琼脂培养基（CLA）进行大型分生孢子的培养，但是利用该培养基产孢需要近紫外灯光的诱导，而且有些菌产大型分生孢子堆的数量少，浓度达不到菌种保存和接种浓度的要求。本研究的甘蔗梢腐病产孢方法产孢量多、产孢速度快，有效解决了甘蔗梢腐病病菌培养过程中产孢少的问题。使用本方法培养3 d 即可得到大量分生孢子，在40 倍显微镜下每个视野30～50 个分生孢子，与PDA 传统培养方法相比，每个视野分生孢子增加6 倍以上，培养时间节省4～7 d。本方法培养基产孢量显著增加，培养周期缩短，有效节约了人力物力及科研工作者的大量宝贵时间，为甘蔗梢腐病病菌变异动态、致病力差异、筛选抗病品种及绿色高效杀菌剂等应用研究提供了技术支撑。