分光光度计法在甘蔗白条病致病菌菌液浓度测定上的应用

孔春艳，毛钧，刘新龙，林秀琴，魏春燕，徐超华，李旭娟，刘洪博，李纯佳，陆鑫

（1.云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远 661699；2.广西农业科学院甘蔗研究所，南宁 530007）

0 引言

食糖是关系到我国国计民生的重要农产品，历年来，党中央、国务院高度重视食糖产业的发展，而甘蔗（Saccharumspp.）是我国主要的制糖原料，其蔗糖产量占我国食糖总产量的90%左右[1]。甘蔗属于无性繁殖作物，在甘蔗生产中经过多年的连续种植，易受到黑穗病、梢腐病、锈病、褐条病、白叶病、白条病等多种重要病害带来的严重威胁，导致甘蔗单产长期在低位徘徊。

甘蔗白条病是由白条黄单胞杆菌[Xanthomonas albilineans（Ashby）Dowson]引起的细菌性病害，是甘蔗三大细菌性病害之一[2-3]。X.albilineans属γ 变形菌纲黄单胞菌属，为革兰氏阴性菌，菌体细长杆状，大小0.25～0.3µm×0.6～1.0 µm，单生或成链，极生单根鞭毛；菌落形态为圆形，颜色呈浅黄色或蜜黄色，边缘整齐，中间隆起，无流动性，专性好氧，最适生长温度25～28 ℃，不仅有抗生素抗性，还具有较强的传染性[4-5]。甘蔗白条病于1908 年在斐济群岛发生，首次于1911 年在澳大利亚出现文献记录，目前全球有包括巴西、印度、中国、泰国等66个国家和地区都相继报道了该病害的发生[6-7]。我国于1980年在福建、广东、台湾省出现了此病害的报道[8]。甘蔗白条病在2007 年已被列为《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》的320号检疫对象[9]。但近年来，该病害在我国广西、云南、海南、浙江等蔗区均有报道发生，且在我国甘蔗主产区有扩大蔓延的趋势[9-12]。X.albilineans侵染甘蔗植株后，产生粘液，堵塞蔗茎维管束，从而减缓水分和养分在甘蔗体内的运输速度，导致甘蔗生长缓慢，严重时造成植株坏死，该病的发生可导致10%～34%的甘蔗产量损失，对蔗糖产出率造成极大影响[7,13-15]。

为确保蔗糖的生产安全及蔗糖产业的可持续发展，培育优良的抗病品种是病害防控最经济、最有效的方法，也是一项重要的绿色防控措施[1,16-17]。在抗病品种选育过程中，如何快速、准确地鉴定育种亲本和育种材料的抗性等级是育种工作成败的关键。为保证甘蔗白条病抗性鉴定结果的准确性，提高接种工作的效率，首先需要解决的关键问题是确定白条黄单胞杆菌接种菌液的浓度。因此，研究并建立一种可以快速测定白条黄单胞杆菌菌液浓度的方法具有重要的现实意义。

常见的测定细菌菌液浓度的方法主要有比浊法、显微镜计数法和平板计数法[17-18]。比浊法虽然方便迅速，但容易受外界因素干扰，得到的结果较为粗略[17]。显微镜计数和平板计数法与比浊法相比，两种方法虽然准确性较高，但均存在操作不便、耗时长等缺点[17-18]。此外，ATP 荧光计数法及流式细胞仪等新方法、新设备已成功用于测定细菌浓度，但这些新设备价格昂贵，在普通实验室中并不常见[18-19]。曹国珍等研究表明细菌菌悬液的OD 值与菌液浓度之间呈正相关，通过测定细菌菌悬液OD 值可以确定菌液浓度[18,20-22]。鉴于此，本研究以白条黄单胞杆菌为研究对象，分别在4种特定波长下分析不同浓度的细菌菌悬液OD值与平板计数值，研究二者之间的线性关系，从中筛选出最优标准曲线回归方程。建立一种利用分光光度计快速测定白条黄单胞杆菌菌液浓度的方法，从而提高甘蔗白条病致病菌人工分离和接种鉴定试验的效率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、培养基

白条黄单胞杆菌菌株（LB-1）[23]由广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所提供。

XAS固体、XAL液体培养基参考DAVIS等[24]所述成分，在云南省甘蔗遗传改良重点实验室进行配制。

1.1.2 主要仪器

紫外可见分光光度计（型号UV-5800PC，上海元析仪器有限公司），生物安全柜（型号AC2-4S1，新加坡艺思高公司），恒温培养箱（型号IFC-110-8，北京陆德恒泰商贸有限公司），恒温振荡器（型号THZ-C-1，苏州培英实验设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 白条黄单胞杆菌标准菌悬液的制备

将保存在-80 ℃的白条黄单胞杆菌冻存液解冻，取100µL 菌液放入1 mL XAL 液体培养基中，于28 ℃、200 r/min 振荡培养18～24 h；再取100µL 震荡培养好的菌液放入无菌XAS 固体培养基中，涂布均匀后放入28 ℃恒温箱培养5 d，后用接种环以无菌操作挑取XAS固体培养基上的白条黄单胞杆菌单菌落，接种到在新的XAS固体培养基中，于28 ℃恒温培养箱中培养5 d，获得纯化的白条黄单胞杆菌。用10µL无菌吸头挑取纯化后的白条黄单胞杆菌单个菌落放入20 mL XAL液体培养基中，28 ℃、200 r/min振荡培养36～48 h，取全部菌液于3 500 r/min 离心15 min，去上清液，加入10 mL 无菌生理盐水重悬细菌，制备成白条黄单胞杆菌标准菌悬液。

1.2.2 不同稀释度菌悬液OD值测定

取5 支无菌试管，分别加入1、3、4、4.5、4.75 mL 无菌生理盐水，再依次添加4、2、1、0.5、0.25 mL标准菌悬液，使每只试管内混合液体积总量达到5 mL。充分混匀后，配制成一组菌悬液浓度梯度为80%、40%、20%、10%、5%的菌悬液，以无菌生理水为空白对照，各取1 mL菌悬液，在波长420 nm、450 nm、600 nm、660 nm 下用分光光度计进行OD 值测定，每个样重复测定3次。

1.2.3 平板计数

吸取上述稀释得到的不同浓度梯度的系列菌悬液，分别用无菌生理盐水按10 倍比例稀释成不同浓度菌液。选取菌落数在30～300 个的平板作为菌落总数测定的标准[18]，经预实验，从而确定稀释度为80%、40%、20%取10-7菌悬液，为10%、5%取10-6菌悬液，用于菌落平板计数。各取1 mL不同稀释度的菌悬液于一次性灭菌培养皿中，每个培养皿3 次重复，涂布均匀后放入28 ℃恒温箱培养中培养5 d。记录下各平板上的菌落数，并乘以其对应的稀释倍数，最终计算出不同浓度菌悬液的菌液浓度。

1.2.4 标准曲线建立与准确性验证

在4 个波长下，以分光光度计测定的不同稀释浓度白条黄单胞杆菌菌悬液OD 值为自变量x，以平板计数法获得的对应稀释浓度菌悬液细菌浓度为因变量y，分别建立二者间的标准曲线。

分别重新培养3 管白条黄单胞杆菌菌液（分别记为X-1、X-2和X-3），对其进行平板计数并于最佳测定波长下检测其OD值，方法同上。将测定所得的不同浓度下白条黄单胞杆菌菌悬液OD值带入标准曲线回归方程所得到的值与实际平板计数值，二者之间进行对比验证，评估标准曲线的准确性。

1.2.5 统计分析

数据统计分析和作图采用SPSS 21、Excel 2016软件，结果以平均值±标准差来表示。回归方程的误差通过均方根误差（RMSE）和相对均方根误差（NRMSE）进行评价，回归方程的决定系数（R²）作为建立回归方程的参考指标[25]。

2 结果与分析

2.1 白条黄单胞杆菌平板计数与OD 值测定结果

根据比尔定律，溶液浓度过高或过低均会导致测定结果有偏差[18,20-22]，因此对不同波长下OD值范围进行分析选择，在4个波长下测定得到不同浓度的白条黄单胞杆菌菌悬液OD值与平板计数值的结果（表1）。

表1 不同浓度下白条黄单胞杆菌菌悬液OD 值和平板计数值Table 1 OD and plate counting values of Xanthomonas albilineans bacterium suspensions under different concentration

2.2 测定波长的选择与标准曲线的建立

在4 种测定波长条件下分别建立菌液OD 值与平板计数结果的标准曲线和线性回归方程。结果如图1所示，4 种测定波长对应的线性回归方程决定系数R2均大于0.95，表明白条黄单胞杆菌细菌数量与OD 值之间均呈现出较好的线性关系[18,20-22]。

图1 分别在420 nm（a）、450 nm（b）、600 nm（c）、660 nm（d）波长下的标准曲线回归方程Fig.1 Regression equation of standard curve under the wavelength of 420 nm(a),450 nm(b),600 nm(c),660 nm(d)

其中，在波长420 nm 下，当OD 值为0.106～1.938 时，建立的回归方程为y=6.1656x-0.2904，RMSE=0.49×108cfu/mL，NRMSE=9.29%，R2=0.9882；在波长450 nm 下，当OD 值为0.094～1.786 时，建立的回归方程为y=6.7107x-0.1623，RMSE=0.42×108cfu/mL，NRMSE=7.97%，R2=0.9918；在波长600 nm 下，建立的回归方程为y=11.263x+0.117，RMSE=0.26×108cfu/mL，NRMSE=4.93%，R2=0.9967；在波长660 nm 下，建立的回归方程为y=13.779x+0.1487，RMSE=0.30×108cfu/mL，NRMSE=5.69%，R2=0.9957。

根据决定系数最大化和均方根误差最小化原则，在4 个波长下，当波长为600 nm 时，线性回归方程的决定系数R2值最大，为0.9967；RMSE值最小，为0.26×108cfu/mL，NRMSE值最小，为4.93%。因此，确定测量白条黄单胞杆菌菌液浓度的最佳波长为600 nm，最优标准曲线建立的回归方程为y=11.263x+0.117。

2.3 标准曲线的准确性验证

在最佳波长600 nm 下，分别测定重新培养的3 管白条黄单胞杆菌菌液OD 值，将测定所得的OD 值带入标准曲线回归方程所得到的值与实际平板计数值，二者之间进行对比验证。验证结果表明，同一方法检测得到的不同菌液样本浓度差异显著，而不同方法检测得到的同一菌液样本浓度差异不显著（表2）。表明在600 nm 波长下通过测定白条黄单胞杆菌菌液的OD 值，建立最优标准曲线回归方程可以对菌液浓度进行非常准确估算。

表2 在600 nm 波长下建立的白条黄单胞杆菌标准曲线准确性验证Table 2 Verification of standard curve accuracy established at 600 nm wavelength in Xanthomonas albilineans

3 讨论与结论

甘蔗白条病是一种传染性较强的细菌性种传病害，主要通过带病种苗的运输进行远距离传播，也可能通过刀具等收获工具进行传播，还可通过气流[26]、雨水[27]、甘蔗花序[28]、土壤[29]以及人畜活动等途径进行传播[30]。含有病菌的甘蔗容易通过调种或引种的方式在不同国家和国内不同的蔗区之间传播，这给甘蔗白条病的防治和检疫带来很大困难[1]。该病害通常在较长的潜伏期内不表现症状，或症状表现不明显，一旦遇到环境适合时便突然暴发，特别是当种植甘蔗品种为不抗病品种时，大面积暴发感染会造成严重产量损失[3,31]。

甘蔗作为一种高度杂合、遗传背景复杂的无性繁殖作物，利用传统杂交法改良甘蔗品种特性周期长、优异性状聚合育种几率小，且近年来，甘蔗白条病发生越来越严重，分析其原因，与甘蔗品种抗病性较差、气候条件适宜及防治不利等因素有关，其中，品种的抗病性差是主要因素之一[1,10,32-33]。在抗病品种选育过程中，抗病性鉴定是甘蔗抗病育种工作重要环节之一。甘蔗白条病的抗病性鉴定方法，可分为田间自然条件下抗性鉴定和人工接种抗性鉴定。其中，由于田间自然条件下抗性鉴定中外界环境条件不可控，且调查周期长，因此鉴定结果准确性不高；而通过人工接种进行抗病鉴定筛选，可以缩短调查时间，便于控制发病因素，可以准确地反映材料抗性水平[1,5]。

为了测定白条黄单胞杆菌菌悬液浓度，在本研究的前期预试验中，采用了显微镜直接观测计数法来测定白条黄单胞杆菌菌液浓度，但由于该菌体积小，需要染色后方能在油镜下进行观察，故显微计数法不适于白条黄单胞杆菌的浓度测定。此外，还采用平板计数法对白条黄单胞杆菌进行浓度测定，但由于该菌在在人工培养基中生长缓慢，一般至少培养4～6 d，平板计数法不仅耗时费力，且实验安排稍有疏漏就会导致实验结果不准确[4,17]。已有不少关于利用分光光度计法测定细菌菌液浓度方法的报道，该方法简便、快速，且结果也可靠，而且分光光度法是一种很成熟的方法[18,34-35]。马培培等利用分光光度计法实现对大肠埃希菌菌液浓度的快速测定[18]。刘国红等通过分光度计法可以快速地检测芽胞杆菌菌液浓度[22]。肖敏等也同样利用分光光度计法快速确定金黄色葡萄球菌菌液浓度[34]。因此，本研究采用分光光度计法，分别在420 nm、450 nm、600 nm 和660 nm 波长下测定白条黄单胞杆菌菌悬液的OD 值，并建立标准曲线进行菌液浓度的估算，在4 个测定的波长中，确定白条黄单胞杆菌菌液浓度测定的最佳波长为600 nm，最优回归方程为y=11.263x+0.117。此外，利用分离培养的白条黄单胞杆菌菌悬液样品检测数据进一步验证，结果显示，最优标准曲线的回归方程预测值与平板计数值结果无显著差异（P>0.05），表明分光光度计法测定白条黄单胞杆菌菌液浓度更为简单、快速和准确。目前，本课题组已利用分光光度计法法测定和配制适当浓度的白条黄单胞杆菌菌悬液，完成了222 份甘蔗种质资源的白条病抗性人工接种鉴定工作，从中筛选出‘台98-0432’、‘28NG251’、‘K84-200’、‘F160’和‘桂糖11-2211’5个材料高度抗病，可作为抗性亲本用于甘蔗抗白条病育种。

本研究建立了分光光度计法测定白条黄单胞杆菌菌液浓度的方法，该方法与传统测定细菌菌液浓度方法相比，具有操作简单、快速、准确等特点，可作为白条黄单胞杆菌菌液浓度的测定方法，也可为其它微生物浓度测定提供借鉴。