多元法分析高能电子束辐照对白芷挥发性成分的影响

舒晓燕，周 鑫，蒋 维，任 玲，谢晓婷，侯大斌

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621000）

白芷为伞形科植物白芷（(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. H.）或杭白芷（(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var.(Boiss.)Shan et Yuan）的干燥根，主产于四川、浙江、河南、河北等，是食药两用材料。其具有丰富的药用和食用价值，主要成分为香豆素和挥发油类。白芷挥发性成分种类、数量繁多，主要含有十二碳醇、十五烯醇、萜品烯等，它是白芷活性物质之一，药理研究表明其具有抑制黑色素、镇痛和抗过敏等作用。同时挥发性成分为白芷提供独特的香气成分，使白芷具有香白芷称誉，在护肤品、香料等方面也具有巨大的开发和利用潜力。为进一步开发利用白芷挥发油，可采用电子鼻（electronic nose，E-nose）与顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术对挥发性成分进行定性识别，并定量分析，2 种技术已普遍应用于食品、脂质微粒自氧化及环境检测中，是较为成熟的分析风味物质的手段。

高能电子束系高能电子加速器（10 MeV）发射出的电子束，与传统Coγ射线辐照一样具有杀菌灭虫、保鲜、改性等作用，且处理时间更短、效率更高、辐照均匀，不产生放射性废物，广泛应用于食品、药品、医疗器械等行业。目前还未有高能电子束辐照处理白芷，关于挥发性成分变化的相关研究。本实验利用高能电子束辐照处理白芷样品，采用电子鼻结合HSSPME-GC-MS对其香气及其呈香成分进行分析鉴别，采用偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）挥发性成分、电子鼻与GC-MS之间的关联性，并通过主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析（clustering analysis，CA）和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）比较样品辐照前后及不同辐照剂量处理白芷挥发性成分的异同，探明高能电子束辐照对白芷挥发性成分的影响规律，为白芷利用高能电子束辐照应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

白芷购于四川省中兴药业有限公司，产地四川省遂宁市。经西南科技大学药用植物研究室侯大斌教授鉴定为伞形科植物白芷（(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. H.）的干燥根。

1.2 仪器与设备

GJ-2高能电子加速器（10 MeV） 四川省眉山市彭州区润祥辐照有限公司；PEN3电子鼻 德国Airsense公司；SPME萃取手柄、65 μm PDMS/DVB SPME萃取头赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Saturn2100 GC-MS联用仪 美国瓦里安技术中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将白芷样品平整装入PET/PE复合材料袋，辐照剂量设置为0（对照）、1、3、5、7、10 kGy，双面辐照。样品经粉碎，过筛，密封保存，备用。

1.3.2 电子鼻检测

称取1.0 g白芷粉末装入15.0 mL顶空瓶中，室温下插入电子鼻探头吸取顶端空气进行测定。测试条件：载气为高纯空气，进气流速600.0 mL/min；预采样时间5.0 s，数据采集时间为120.0 s，采样周期为1.0 s，自动冲洗时间为100.0 s。电子鼻各传感器信息见表1。

表1 PEN3型便携式电子鼻传感器性能描述Table 1 Performance description of PEN3 portable electronic nose sensors

1.3.3 HS-SPME法提取风味物质

选用65 μm PDMS/DVB萃取纤维头在GC进样口活化30 min，活化温度250 ℃。活化后插入装有1.0 g白芷粉末的顶空瓶中，60 ℃水浴萃取30 min，然后将纤维萃取头插入GC进样口解吸3 min。

1.3.4 GC-MS条件

GC条件：初始温度80 ℃，保留1 min后，以6 ℃/min速率升温至180 ℃，再以10 ℃/min速率升温到220 ℃，保留8 min，进样口温度250 ℃，SPME不分流，载气（氦气）流速1.0 mL/min。

MS条件：电子电离源；电离电压70 eV；离子源温度260 ℃；质量扫描范围30～600 u。

1.4 数据处理

1.4.1 PCA和LDA

取稳定后第68～70秒的电子鼻传感器数值信息，使用电子鼻系统自带软件Winmuster对数据进行PCA和LDA。

1.4.2 GS-MS数据分析

用标准质谱数据库NIST98进行匹配对照解析，选用匹配度80%以上结果；采用峰面积归一化法计算相对含量。GC-MS采用Excel处理数据、Origin 8.5.1绘图、Simca13.0进行PCA、CA、PLS-DA。

2 结果与分析

2.1 电子鼻测定结果

2.1.1 辐照前后白芷电子鼻特征气味雷达指纹图分析

电子鼻是根据一系列传感器，结合多元统计学方法获取样品中挥发性物质的完整信息。提取10 个传感器的特征值，选取68～70 s其中1 s绘制高能电子束不同剂量辐照处理的白芷电子鼻特征气味雷达指纹图，结果见图1。

图1 辐照前后白芷特征气味雷达指纹图Fig. 1 Characteristic odor radar fingerprints of Angelicae Dahuricae Radix before and after irradiation

雷达指纹图反映了对白芷气味最敏感的电子鼻传感器，即7号传感器（表征为硫化物）和9号传感器（表征为芳香成分），推测白芷气味中的主要物质可能为硫化物和芳香类物质。由图1可知，各辐照组（1～10 kGy）白芷样品特征气味高度重合，未区分出其差异，但与对照组（0 kGy）差异较大。辐照处理后，7号传感器响应值仍最大，9号传感器响应值未发生变化，表明白芷辐照后主要挥发性成分未发生改变；但6号传感器响应值增大，其表征为甲烷成分，即高能电子束辐照会使白芷气味增加甲烷物质。

2.1.2 PCA结果

PCA是将可能有相关性的变量以正交变换的方法转为线性不相关变量，通过降维原始数据，找到最大贡献率的因子，提取原始数据中最大的几个特征向量为PC，并且通过二维图体现样品间的差异。

图2 不同辐照剂量处理后白芷气味PCA图Fig. 2 PCA plot of Angelicae Dahuricae Radix odor after irradiation at different doses

由图2可知，PC1和PC2的贡献率分别为89.74%、8.54%，总贡献率达98.28%，表明可以较好地反映辐照前后白芷挥发性气味全部特征信息。各样品界线清晰，不同处理间的挥发性气体存在差异。0～3 kGy处理组在PC1与PC2距离较短，表明这3 个样品相似度较高；5～10 kGy处理组在PC2及PC1距离较短，此3 个样品相似度较高；3 kGy与5、10 kGy处理组距离较近，因此，需结合LDA进一步探究不同样品挥发性物质的区别。

2.1.3 LDA结果

图3 不同辐照剂量处理后白芷气味的LDA图Fig. 3 LDA plot of Angelicae Dahuricae Radix odor after irradiation at different doses

LDA是模式识别中的一种经典算法，通过降维数据，凸显类间的差异，减小类内的差异，更好地分析样品间的差异性。如图3所示，PC1贡献率为52.87%，PC2贡献率为36.18%，总贡献率为89.05%，能很好区分不同样品。6 个处理样品都有各自的香气区域，所有的样品根据PC1即横坐标跨度的不同可以完全分开，即不同辐照剂量处理样品香味物质可以区分开。与PCA相比，LDA的区分效果更好。结合图2、3可以看出，0、1、3 kGy剂量辐照处理后的样品气味区域较为集中，3、5、7、10 kGy辐照处理后的样品气味区域较为集中，说明风味物质相似；0～3 kGy和5～10 kGy样品气味区域在PCA纵坐标和LDA横坐标上存在跨度，推测高于3 kGy剂量辐照对白芷气味有较大影响。综合可知，电子鼻能够区分经高能电子束不同剂量辐照处理的白芷样品，将6 个实验组分为0～3 kGy和5～10 kGy两类，即低于5 kGy的辐照处理对白芷气味无明显影响。

2.2 白芷的GC-MS分析

2.2.1 主要香气成分及相对含量

表2 白芷中挥发性成分的种类及相对含量Table 2 Types and relative contents of volatile components in Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

为进一步分析高能电子束辐照处理对白芷挥发性成分产生的影响，利用HS-SPEM-GC-MS联用技术，采用峰面积归一化法计算相对含量。由表2可知，对照组（0 kGy）的挥发性成分17 种，其中醛类3 种、醇类2 种、酯类5 种、烃类6 种、其他2 种。由各类成分占比可知，酯、烃类相对含量较高，占45.64%，是白芷主要风味物质，这与Zhao Aihong、李伟等对白芷挥发油的研究结果相似。烃是碳氢化合物的统称，可以产生原生的、浓郁的香气为白芷提供了丰富的香味。其次，醛、醇类成分也占有较大比例，这类化合物一般是脂质的降解产物，具有独特的香气。

经高能电子束1～10 kGy剂量辐照后，白芷的挥发性成分分别为54、64、59、53、58 种，物质种类明显增多；烃类成分比例仍最大，分别为21.99%、38.45%、23.24%、23.45%、33.86%；酯类成分相对含量下降；随着辐照剂量增大，醛类物质相对含量增加；产生了新物质——酮类。研究表明酯类物质可转化为醛、酮类，此类物质可能引起“辐照味”，其含量越高，即辐照异味愈浓烈，高剂量辐照组与低剂量组样品气味有明显差异。此分析结果与电子鼻检测结果一致，表明“辐照味”的来源极大可能为醛、酮类物质，两者间的具体联系还需进一步研究。不同辐照处理样品中挥发性物质名称及相对含量见表3。

表3 不同辐照剂量处理下白芷的挥发性物质分析结果Table 3 Relative contents of volatile substances in Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

续表3

续表3

续表3

续表3

由表3可知，辐照前白芷主要成分为2-乙基己基酯乙酸（5.16%）、四甲基吡嗪（6.12%）、正十四碳烷（7.22%）、1-乙烯基-1-甲基-2,4-双(1-甲基乙烯基)-[1-(1,2,4)]-环己烷（7.16%）、丁香油烃（7.05%）、正十三烷（6.17%）等烷烃类物质，与Chen Qinhua等对白芷挥发性物质的研究结果一致。样品经高能电子束不同剂量辐照后，2,3-丁二醇、辛醛、十二醛、壬醛、四甲基吡嗪仍能检出，其中2,3-丁二醇相对含量下降、十二醛相对含量上升；其他13 种成分中，(1)-2,6,6-三甲基双环[3.1.1]庚-2-烯在3、5 kGy辐照组中未检出，在1、7、10 kGy辐照组中检出，但相对含量较小，可能是高能电子束辐照未完全辐解此物质；其余12 种酯、烃类物质在辐照组中未检出，推测高能电子束对酯、烃类物质敏感，使其完全辐解。

辐照后白芷挥发性成分比辐照前更为丰富，可能是白芷中的一些物质经高能电子束辐照后发生裂变反应，产生了新的物质。1 kGy辐照组中主要物质为石竹烯（9.11%），3 kGy辐照组主要为-榄香烯（13.92%），5 kGy为四甲基吡嗪（9.08%），7 kGy为十二醛（11.99%）；10 kGy为十二醇（15.14%）。辐照后样品中增加了烃类等香气成分，可能是由于芳香族氨基酸较其他氨基酸对辐照更为敏感，易发生脱氨基、氧化和脱羧反应。

辐照组产生了酮类物质，此类化合物多由不饱和脂肪酸氧化、热降解、氨基酸降解或微生物氧化产生。由此可推断其来源可能是2-乙基己基酯乙酸、丁基2-乙基己基酯碳酸、1-乙烯基-1-甲基-2,4-双(1-甲基乙烯基)-[1-(1,2,4)]-环己烷、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇三异丁酸酯等酯烃类物质，化学结构中的C—O、O—H等化学键经辐照后断裂，形成C＝O双键，从而生成酮类化合物。

2.2.2 挥发性物质PCA结果

根据因子的特征值、累计贡献率及碎石图拐点的变化趋势等因素确定PC，且根据特征值大于1分析PC载荷矩阵与特征向量。如表4所示，2 个PC即可完全反映样品的主要特征信息。

表4 PCA解释总差异Table 4 Total variance explained

表5 PC载荷矩阵与特征向量Table 5 Principal component loading matrix and eigenvectors

根据PC与提取的特征向量之间的关系，可以得到2 个PC与原变量之间的线性关系，由表5可得回归方程：

以PC1、PC2的方差贡献率为权重系数，引入综合评价函数建立白芷风味物质识别评价模型，得到PC=0.513 52 PC1+0.259 81 PC2。利用权重系数将高能电子束不同剂量辐照组进行排名分析，计算结果如表6所示。

表6 白芷综合评分得分及分类Table 6 Comprehensive scores and classification of Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

由表6可知，0、1、3 kGy辐照剂量组样品综合得分均大于0 分，5、7、10 kGy辐照剂量组样品综合得分均小于0 分，表明0～3 kGy剂量辐照组白芷样品的挥发性成分较为接近；5～10 kGy剂量辐照组样品挥发性成分较为接近，与电子鼻分析结果一致。可以推测高能电子束辐照剂量高于3 kGy时，白芷的挥发性成分可能会发生明显变化。

2.2.3 GC-MS的CA结果

CA是使用平均联接（组间）的谱系图、重新标度的距离聚类组合，将样品分成多个类的分析方法，分类更全面具体。以6 类挥发性成分为变量，对高能电子束不同剂量辐照的白芷样品挥发性成分进行CA，结果见图4。

图4 不同剂量辐照白芷的挥发性成分CA图Fig. 4 Cluster analysis dendrogram of Angelicae Dahuricae Radix irradiated at different doses

由图4可知，当横坐标距离为10 时，6 个实验组可以分为2 个类群，分别是0～7 kGy剂量（5 个实验组）辐照组归为1 个类群，10 kGy辐照组单独归为1 个类群。当类间距为5 时，5 个实验组被分为3 类，7 kGy辐照组单独为1 个类群，5 kGy辐照组单独为1 个类群，0～3 kGy此3 个实验组为1 个类群，这与PCA结果一致。

CA可根据刻度的不同获得多种分类结果，而PCA根据PC得分仅获得一种分类结果，将PCA、CA及电子鼻定性分析相结合，可以较全面地分析高能电子束辐照处理对白芷香气成分的影响。

2.3 电子鼻与GC-MS的PLS-DA结果

图5 挥发性物质电子鼻传感器PLS-DA（A）和置换检验图（B）Fig. 5 PLS-DA plot of volatile substances using E-nose sensors (A) and permutation test (B)

PLS-DA是对不同处理样品的特性分别进行训练，产生训练集并检验训练集的可信度的多变量统计分析方法。选取电子鼻10 个传感器与GC-MS检测出的挥发性物质进行PLS-DA，结果见图5、6。

验证结果中的和与纵轴的截距分别为0.258和-0.326，鉴别模型最右端的原始值大于左边任何一个变量的值，说明所构建的PLS-DA有较好的稳定性和可靠性。由图5可知，W3S、W3C、W6S、W2C、W5S传感器与酯烃类物质相关性较高，此类传感器能较好的识别酯烃类物质，但酯烃类阈值较高，在传感器中响应值应较小，雷达图结果符合PLS-DA结果。表明电子鼻对白芷挥发性成分区分识别度较好。

3 结 论

基于电子鼻和GC-MS技术，研究高能电子束辐照处理对白芷样品中挥发性成分的影响，并采用PCA、LDA、CA和PLS-DA统计分析数据。电子鼻能较好地区分不同剂量辐照处理后的白芷气味，GC-MS技术可在电子鼻的基础上进一步分析白芷挥发性成分种类、相对含量的变化，其分析结果一致。白芷中主要挥发性成分为酯烃类化合物，高能电子束辐照会使白芷产生新的化合物——酮类物质，但不高于3 kGy剂量辐照对白芷挥发性成分无明显影响。本实验为高能电子束辐照对白芷挥发性成分的影响提供了理论参考，通过研究挥发性成分的变化可知不高于3 kGy剂量为辐照适宜剂量，但对其具体成分的影响课题组还在进一步研究中。