分散蓝2BLN染料废水脱色菌分离鉴定及特性研究*

王屿森，范晓丹，张道虹，龚 毅，裴润竹，刘 爽，周王旭，张博琳

(天津城建大学环境与市政工程学院，天津市水质科学与技术重点实验室, 天津 300384)

近年，我国染料的年产量可以占到70%，位居世界首位[1-2]。染料废水是难处理工业废水之一，染料及其降解产物能够产生具有诱变和致癌性质的剧毒芳香化合物[3-5]。而蒽醌染料是第二大类染料，在合成染料中占有重要的地位。蒽醌染料不仅结构复杂，难降解，还存在潜在的毒性，严重污染生态环境[6]。染料废水的常规处理方法包括吸附、膜分离、好氧法厌氧法、化学氧化和高级氧化等。国内外以生物法为主，与物理、化学法相比，传统生物法具有运行成本低、操作简单、不会造成二次污染等优点[7-8]。近年来，人们致力于研发各种高效脱色菌株，利用其生物降解染料废水中的污染物。已发现对染料废水有降解作用的微生物，如细菌和真菌藻类等[9-10]，菌可通过自身的新陈代谢将染料降解中有毒物质[11]分解成小分子物质，大大降低了印染废水的危害。

本研究从活性污泥中筛选对蒽醌分散蓝2BLN染料废水具有高效脱色能力的功能菌，研究影响其高效脱色的因素，探究其对蒽醌分散蓝2BLN染料废水的降解途径。旨在为高效功能菌应用于处理分散蓝2BLN染料废水提供理论研究成果。

1 材料与方法

1.1 染料废水

分散蓝2BLN染料废水：实验室配制。

1.2 污泥驯化与菌种筛选

取天津市某污水处理厂的活性污泥，接种于含5 mg·L-1分散蓝2BLN培养基中，30 ℃、转速为150 r·min-1的条件下振荡，梯度驯化。将驯化后的活性污泥经不同倍数(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8)稀释后，取2 μL均匀的涂布于LB固体培养基上(含10 mg·L-1分散蓝2BLN)，30 ℃条下静置培养2 d，经过3～4分离纯化后，得到一株对可降解蒽醌分散蓝2BLN染料的高效功能菌，命名为GN-1。

1.3 培养基

LB固体培养基：蛋白胨、酵母浸膏、琼脂粉、氯化钠、pH为7.0。

富集培养基：蛋白胨、酵母浸膏、氯化钠、pH为7.0。

脱色培养基：蒽醌分散蓝2BLN染料、葡萄糖、蛋白胨、氯化钠、三氯化铁、硫酸镁、磷酸二氢钾、无水氯化钙、pH为7.0。

1.4 菌种鉴定

提取菌株基因组DNA作为模板，使用上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和下游引物1492R：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’进行16SrDNA扩增、凝胶电泳和纯化回收等步骤，将获得的16rDNA序列通过BLAST程序与GenBank中核酸数据比对分析进行菌种鉴定。

1.5 菌种的脱色试验

将菌株GN-1接种到200 mL液体培养基中，在30 ℃和转速为150 r·min-1的条件下富集得到菌液，将20 mL菌液加入到180 mL脱色培养基中进行脱色试验。30 ℃、pH=7、葡萄糖、蛋白胨为碳氮源条件下静置培养，每隔2 h取上清液进行离心15 min，在538 nm处测离心后上清液吸光度，并依据下列公式计算脱色率。

(1)

式中：T为脱色率，%;A为复杂染料废水初始吸光度;At为染料废水反应后吸光度。

1.6 菌株GN-1对分散蓝2BLN染料废水脱色影响因素的研究

将20 mL富集后的菌株GN-1种子液接种到180 mL脱色养基中，研究不同碳氮源、温度、pH值、分散蓝2BLN染料废水初始浓度、NaCl浓度以及菌种的接种量等因素，见表1所示，对菌株GN-1脱色能力的影响。

表1 脱色的影响因素

1.7 分析方法

1.7.1 紫外-可见光谱分析

将种子液按接种量为10%(V/V)接种于含60 mg·L-1分散蓝2BLN的选择培养基中，在30 ℃，150 r·min-1的培养箱中培养，隔一段时间从中取出4 mL，取离心后的上清液，用紫外—分光光度计在200～700 nm波长范围内进行扫描，分析分散蓝2BLN染料废水的降解产物。

1.7.2 GC-MS分析

将处理后水样和原水水样固相萃取后按照一定条件进行GC-MS分析，分析分散蓝2BLN染料废水的降解产物。

2 结果的分析与讨论

2.1 脱色菌株的鉴定

经分离、纯化后得到菌株GN-1经染色后呈红色，为革兰式阴性菌，菌株GN-1的生理生化实验结果，如表2所示。

表2 菌株GN-1的生理生化实验结果

对菌株GN-1进行PCR扩增后测序，测得序列长13966bp，该序列与嗜水气单胞菌属(Aeromonashydrophila)的序列同源性较高,其登录的序列号为MK007301.1，判断该菌为嗜水气单胞菌。

2.2 菌株GN-1脱色的影响因素

图1 温度对菌株GN -1脱色效果的影响

图1是温度对菌株GN-1脱色效果的影响，由图1可得，在20～40 ℃对分散蓝2BLN染料废水的脱色率随温度的升高呈先升高后降低的变化趋势。在20 ℃时，脱色率仅为40.9%，温度在30～35 ℃时脱色效果显著，脱色率都可达到80%以上，30 ℃时其脱色率高达85.29%，这是因为微生物的生物降解活性受温度的影响[12]，温度过低，抑制微生物的生长，使酶的活性降低，代谢效率下降，不利于菌株GN -1降解染料。当温度40 ℃时脱色率明显下降仅为30.19%，这是因为温度的升高虽然可以增大酶的活性，但会加速菌株的老化和代谢衰退，因此菌株GN-1最适温度为35 ℃，表明属于嗜中温菌。Bouraie等[13]在研究嗜水性气单胞菌降解染料活性黑5时的实验结果与本研究一致。

图2 接种量对菌株GN -1脱色效果的影响

图2是接种量对菌株GN -1脱色效果的影响。 由图2可知，分散蓝2BLN的脱色率与接种量呈正相关，当接种量为10%时，6 d脱色率为92%，接种量为20%时，仅4 d脱色率就高达96.27%，说明加大接种量可以缩短反应周期；当接种量大于10%时，4 d的接种量均达到80%以上，随着反应时间的延长，脱色率并无明显的增大，这是因为菌种浓度过大时，菌体之间相互竞争，导致菌株处于贫营养状态，在一定程度上限制了菌株生长代谢，使得降解缓慢，由此可见当投加量大于10%时，脱色率增强的不明显，所以从经济效益角度考虑菌株GN-1的最佳接种量为10%。

图3 盐度值对菌株GN -1脱色效果的影响

图3是盐度对菌株GN-1脱色效果的影响，由图3可见，当盐度为1%时，脱色率达到最大值84.57%，当盐度从3%～10%逐渐增大，分散蓝2BLN的脱色率逐渐减小。这是由于盐分过高，导致溶液中基质的传输速率下降，造成降解染料的关键性作用酶失活，能够改变渗透压，造成菌株脱水死亡，进而影响微生物对染料的降解。由此可以得出，菌株GN-1的盐耐受性不是很好。

图4是pH对菌株GN-1脱色效果的影响，由图4可知，pH在2～10范围时脱色率呈先增后减的趋势，pH=2 时，脱色率仅为26.35%，菌株GN-1在pH=6～8时对分散蓝2BLN染料废水的脱色效果较好，可达70%以上。在pH为7时脱色率可达到83.83%，当pH值从7增加到10时脱色率快速下降，可知菌株GN-1最适pH为7。由此可知，菌株GN-1适合在弱酸、中性、弱碱性环境下降解分散蓝2BLN染料废水。据报道，克雷伯氏杆催产菌对活性黑5的脱色[15]以及StaphylococcusHominisSubsp.hominis DSM 20328对活性蓝4的脱色[16]都表明菌株在中性条件能够达到对染料更好的脱色率。

图4 pH值对菌株GN -1脱色效果的影响

图5和图6是碳氮源对菌株GN-1脱色效果的影响，由图5和图6可见，以蛋白胨、葡萄糖为碳源时脱色率较高，均达到80%以上，而未投加碳源的脱色率仅为30.12%左右，此时分散蓝2BLN对菌株GN-1的生长表现出一定的抑制作用，可知外加碳源可以明显提高菌株GN-1的脱色能力，这表明菌株GN-1对分散蓝2BLN通过共代谢的作用实现脱色。以亚硝酸钠、蛋白胨作为氮源时脱色率都可达到80%以上，脱色效果明显， 而以尿素为氮源时，脱色率最差，仅为61%。氮源对分散蓝2BLN的脱色效果影响差别不是很大。

图5 氮源对菌株N1脱色效果的影响

图6 碳源对菌株N1脱色效果的影响

图7是染料初始浓度对菌株 GN-1脱色效果的影响，从图7中可知，染料初始浓度与脱色率呈负相关，染料浓度在20～60 mg/L时，脱色率均达到80%以上，而随着染料浓度的递增，脱色效果急速下降，当染料浓度为100 mg/L时，脱色率仅为27.08%，因为分散蓝2BLN具有生物毒性，毒性随浓度的增高而增大，且其代谢过程产生并积累的高浓度中间产物对微生物细胞也有一定的毒性，能过抑制微生物生长繁殖，降低了微生物生物量以及识别底物的相关性酶浓度的能力。

图7 染料初始浓度对菌株GN-1脱色效果的影响

2.3 分散蓝2BLN染料废水的降解过程

本研究将高压灭菌和未灭菌的种子液对分散蓝2BLN的脱色效果进行比对，如图8所示。高压灭菌的种子液对分散蓝2BLN的去除率呈现出现增加后减少的趋势，且在2 d时出现拐点，其去除率主要由于吸附作用。而另一组未灭菌的实验中，分散蓝2BLN的去除率随着反应时间的增加持续递增，在反应10 d时，达到了100%的去除率。由此说明菌株GN-1对分散蓝2BLN的降解主要以生物降解为主，也伴随了前期的吸附作用，但是吸附的作用很小。

图8 灭菌与未灭菌对分散蓝去除率的影响

2.4 紫外-可见光谱分析

图9是菌株GN-1降解分散蓝2BLN染料废水过程中的紫外-可见吸收光谱图，由图9可知，分散蓝2BLN在最大波长625 nm处出现的吸收峰，随着反应的进行逐渐降低，在10 d时基本消失，此现象是因为分散蓝2BLN蒽醌键的断裂，发色基团消失所导致。分散蓝2BLN在238 nm(峰3)和280 nm(峰2)处的吸收峰也随着反应时间的增加明显降低，且在628 nm处发生了吸收峰的紫移，可能是因为-OH、-NH2等助色集团的脱落，导致发色基团上电子云密度下降所致；因此菌株GN-1对蒽醌分散蓝的脱色主要是由于生物降解的作用。

图9 紫外-可见吸收光谱图

2.5 GC-MS分析

为进一步分析菌株GN-1降解分散蓝2BLN的途径，本研究采用了GC-MS对其不同时间段的降解产物进行分析，如表3所示，蒽醌分散蓝2BLN的中间降解产物有N-(4-叔丁基苯基)(A)、邻苯二甲酸二异丁酯(B)、N-2-(3,4-二羟苯基)-乙基甲胺(C)、2,3-二氢-1,3-二氧-1H-异吲哚-5-羧酸(D)、乙苯(E)、邻二甲苯(F)、甲氧基乙酸甲酯(G)、3-amino-2,2,5,5-tetramethyl-1(H)。因而，推测菌株GN-1降解分散蓝2BLN的途径为共轭分散蓝2BLN结构受到氧化酶的攻击，导致了染料显色基团断裂，产生中间体A、B和C，化合物B通过氧化聚合转化为D，再进一步转化为G和H，化合物A和C分别转化为E和F，最后化合物E、F、G和H发生环裂变和一系列的反应。

表3 分散蓝2BLN降解中间产物(1)

续表3

3 结 论

(1)从活性污泥中驯化分离出分散蓝2BLN染料废水高效脱色菌GN-1，鉴定为嗜水气单胞菌属(Aeromonashydrophila)，将其命名为GN-1。

(2)菌株GN-1对分散蓝2BLN的脱色存在共代谢作用，以葡萄糖和蛋白胨作为碳氮源时，可以显著提高其脱色率；而盐度与脱色率呈负相关，随着盐度增加直至10%时，脱色率仅为16.91%；pH和温度的增加对菌株GN-1降解分散蓝2BLN染料废水呈现出先升高后降低的趋势；加大接种量不仅可以增大脱色率，同时减短了反应周期；本研究最佳降解条件为：温度为35 ℃；pH=7；盐度1%；最佳接种量为10%。

(3)菌株GN-1对蒽醌分散蓝2BLN的脱色以生物降解为主。共轭分散蓝2BLN结构受到氧化酶的攻击，导致了染料显色基团断裂，产生中间体氧化聚合转化、环裂变反应。