检测烷基苯磺酸鉴别地沟油的免疫层析方法研究*

唐桂红，陈华龙，江伟玲，吴帆敏，郭杰标

(1 韶关市食品药品检验所，广东 韶关 512026；2 韶关学院，广东 韶关 512005)

地沟油是煎炸老油、泔水油、废弃油等劣质食药油的统称，含有甲苯、丙醛、苯并芘等危害健康的化学物质[1]。为了禁止地沟油回流餐桌，开发准确高效的地沟油鉴别技术，成为监管部门和研究机构关注的热点。

目前，地沟油检测主要有理化检测法、光谱检测法和色谱检测法。其中物理质检测主要针对：凝固点、透明度、黏度、折射率和电导率[2]；化学检测技术主要针对：酸值、碘值、羟值[3]；光谱学方法包括：紫外光谱法[4]、红外光谱法[5]、拉曼光谱法[6]、核磁共振法[7]、太赫兹时域光谱法[8]、地沟油高光谱透射法[9]；色谱学方法包括：气相色谱检测地沟油中的外源微量成分[10-11]、特殊脂肪酸酯[12]，液相色谱检测地沟油中的胆固醇[13]、辣椒碱和辣椒素[14-15]、黄曲霉素[16]、阴离子型表面活性剂[17]。在以上检测中，基于理化检测方法的专属性不显著，容易发生误检和漏检。而依赖实验室设备的光谱和色谱检测操作复杂，难以现场操作。已在食品检测领域广泛应用免疫层析法[18]，以灵敏特异、快速价廉的特点[19]，引起了研究人员的注意：吴倩等[20]基于检测辣椒碱的免疫层析快速鉴别地沟油，李军涛等[21]建立了检测黄曲霉毒素B1免疫荧光层析法鉴别地沟油，都展示了满意的效果。相比于辣椒碱和黄曲霉毒素B1，十二烷基苯磺酸在地沟油中的残留更为普遍[17，22-24]，研发检测该残留物的免疫层析试剂更有应用前景。

图1 烷基苯磺酸类表面活性剂荧光免疫层析检测

本研究如图1的原理，开发快速检测十二烷基苯磺酸的荧光免疫层析法(Fluorescent immunochromatographic assay, FICA)，为食品安全监管部门提供基于十二烷基苯磺酸残留，快速鉴别的地沟油的可靠工具。

1 材料与仪器

1.1 材 料

1.1.1 实验动物

新西兰大白兔,广州华东信华实验动物中心(证号44007600002936);实验动物在丽珠集团利民制药厂动物中心饲养。

1.1.2 主要药品及试剂

十二烷基苯磺酸钠对照品，默克公司；牛血白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、四甲联苯胺(TMB)、过氧化脲，上海生工生物工程有限公司；对氨基苯磺酸、对磺基苯甲酸、对甲基苯磺酸，阿拉丁化学试剂有限公司；羊抗兔IgG二抗酶结合物，美国Jackson公司；荧光微球(150 nm)，上海杰一生物有限公司；羊抗兔IgG二抗，美国SIGMA公司；NC膜、玻璃纤维膜、PVC衬板、吸水垫，美国Millipore公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器

酶标板，广州洁特；紫外/可见光扫描仪，美国Thermo公司；酶标仪，芬兰Labsystems公司；BioJetXYZ3000型喷膜仪和切条机，上海捷宁公司。

2 方 法

2.1 人工免疫原的合成

如图1根据改良活泼酯法，取2.0 mg对磺基苯甲酸溶于1.0 mL甲醇，加入2.5 mg NHS和3.5 mg EDC，室温震荡反应过夜，生成对磺基苯甲酸活泼酯，10000 rpm离心10 min除去杂质。上清液缓慢滴入含20 mg BSA的0.15 mol·L-1NaHCO3溶液(5 mL)，室温磁力搅拌2 h，合成对磺基苯甲酸免疫抗原。反应完全后，抗原液用生理盐水透析72 h，期间换透析液六次，分装于-20 ℃保存。

2.2 人工检测抗原的合成

如图1根据重氮法，取2.0 mg对氨基苯磺酸溶于1.0 mL甲醇，用盐酸调节pH值到1.0，在冰浴中加入2.5 mg NaNO2震荡反应1 h，生成重氮化对氨基苯磺酸，缓慢滴入含40 mg OVA的pH 8.5 0.15 mol·L-1碳酸缓冲液(10 mL)，4 ℃磁力搅拌2 h，合成对氨基苯磺酸检测抗原。反应完全后，抗原液用生理盐水透析72 h，期间换透析液六次，分装于-20 ℃保存。

2.3 动物免疫

以免疫抗原(对磺基苯甲酸-BSA偶联物)新西兰大白兔进行免疫。首免以完全弗氏佐剂乳化50 μg免疫抗原，背部多点皮下免疫。首免4周后，以不完全弗氏佐剂乳化50 μg免疫抗原加强免疫，之后每3周加强免疫一次，共3次。最后免疫6天后心脏取血，分离血清存放于-20 ℃。

2.4 抗体纯化及特异性的评价

以辛酸-硫酸铵法纯化抗体。参照前期工作的方法[25]，以十二烷基苯磺酸钠、对甲基苯磺酸钠、对氨基苯磺酸钠、对磺基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、苯胺，进行竞争ELISA检测，分别绘制竞争抑制曲线，计算对各药物IC50值，计算交叉反应率。

2.5 荧光微球的标记

按前期工作的方法[26]，采用EDC活化法对羧基化荧光微球标记抗体。取1.0 mL荧光微球稀释在20 mL超纯水中，加入0.05 mL新鲜配制的EDC溶液(10 mg·mL-1)，室温搅拌20 min使羧基活化。将预活化微球分成三等份，分别加入抗苯磺酸抗体至终浓度0.20、0.30、0.40 mg·mL-1，轻微搅拌30 min使活化羧基与抗体的氨基连接。各种抗体浓度标记的微球以16000 rpm低温离心30 min，分别用含10% Triton X-100的PBS溶液重悬微球，4 ℃保存备用。

2.6 免疫荧光微球层析(FICA)试纸的组装

将抗体标记的荧光微球溶液喷在荧光微球释放垫上，真空冻干后备用。用0.01 M PBS分别配制0.15、0.30、0.45、0.60 mg·mL-1的检测抗原溶液，以及0.30 mg·mL-1的羊抗兔IgG二抗溶液。上述梯度浓度检测抗原溶液和固定浓度二抗溶液形成四种组合，用喷涂设备分别在NC膜平行喷涂，构成含不同测试线(T线)和质控线(C线)四种NC膜，在37 ℃恒温干燥后备用。

如图2(a)所示，在60 mm×300 mm的PVC衬垫上，按顺序粘贴样品垫、荧光微球释放垫、NC膜(T线和C线)、吸收垫，用切条机纵向切成5 mm×60 mm的试纸条。

图2 荧光微球试剂条装配示意图(a)和荧光免疫试纸条检测结果的判定(b)

2.7 FICA检测过程和结果判读

用滴管在样品垫加3～4滴样品液，样品液吸收垫运动，并带动在释放垫上的标记荧光微球移动。烷基苯磺酸钠和T线检测抗原竞争性与金标抗体结合，产生检测信号。荧光微球的结果判读：如图2(b)所示，C线和T线都显荧光，样品不含烷基苯磺酸钠；C线显色而T线不显荧光，显示样品含烷基苯磺酸钠；C线如不显荧光，则表明试剂已经失效。

2.8 FICA试纸检测限优化

调整抗体标记浓度和抗原喷涂浓度，优化FICA对SDBS的检测灵敏度。用PBS配制800、400、200、100、50、25 ng·mL-1的烷基苯磺酸钠溶液，按2.7步骤对从高浓度到低浓度进行检测，使T线荧光消失的最后浓度就是试纸条的最低检测限。

2.9 FICA试剂检测油脂中SDBS残留结果验证

在100 mL的纯净食用油中，分别滴加含0.5、1.0、1.5、2.0 μg SDBS的5.0 mL水溶液，充分搅拌后在105 ℃烤箱加热5 h蒸发水分。用5 mL的PBS溶液对5 mL油样品充分震荡抽提，在3000 rpm离心15 min破乳分层。取水相溶液按照2.7步骤检测。每个添加浓度的油脂抽提5次进行检测，分别统计结果对检测性能进行评价。

3 结果与讨论

3.1 抗体特异性的评价

如表1所示，抗体对十二烷基苯磺酸钠具有很好的亲和力。同时，对4-甲基苯磺酸、4-氨基苯磺酸、4-磺基苯甲酸、苯磺酸等含苯磺酸基团的化合物，对ELISA检测(基于4-磺基苯甲酸抗体和对氨基苯磺酸抗原)的竞争抑制效应明显。证明本研究获得的抗体，识别苯磺酸基团的特异性良好，能够用于苯磺酸类表面活性剂的检测。

表1 抗体对8种相关化合物的交叉反应率

3.2 检测线和质控线包被浓度优化

如图3所示，当荧光微球抗体包被浓度达到0.30 mg/mL、检测抗原包被浓度达到0.45 mg/mL，检测线的荧光信号趋于稳定。在此基础上可以对FICA试纸条检出限进行优化。

图3 抗体标记浓度(a)和检测抗原喷涂浓度(b)

3.3 FICA试纸条检测限优化结果

图4 荧光免疫层析试剂(FICA)对SDBS标准溶液的最低检测限验证结果

为了使试剂的检测性能更稳定，优化的FIAC试纸条选用了0.30 mg/mL抗原喷涂T线，选用0.45 mg/mL抗体标记的荧光微球作为检测信号。FIAC试纸条检测SDBS灵敏度验证结果如图4所示，检测结果显示不含烷基苯磺酸钠的结果，C线和T线都显荧光。含25 ng/mL烷基苯磺酸钠的样品，检测线很大程度被抑制。烷基苯磺酸钠浓度等于或大于50 ng/mL，检测线全部被抑制。因此，本FICA试剂对烷基苯磺酸钠完全竞争抑制的检测限是50 ng/mL，完全满足检测油脂中烷基苯磺酸鉴别地沟油的要求。

3.4 FICA试剂检测油脂SDBS检出限的验证结果

在100 mL油脂的添加不同残留量的SDBS，使用本研究开发的FICA试剂进行检测，实验结果如图5所示，SDBS添加量为0.5 μg/100 mL和1.0 μg/100 mL的油脂，全部均未检出阳性结果；SDBS添加量为1.5 μg/100 mL油脂，5个样品检出弱3个阳性结果，2个阳性结果；SDBS添加量为2.0 μg/100 mL油脂，5个样品全部检出阳性结果。

图5 荧光免疫层析试剂(FICA)对添加梯度SDBS标准品的油脂检测限验证结果

根据3.3的FICA试剂的检测限验证结果换算，如果PBS溶液对油脂中的SDBS抽提率为100%，对试剂油脂的检出限应该是0.5 μg/100 mL。由于SDBS是带有长链烷烃的表面活性剂，较强的油溶性使其水溶剂抽提率不会太高[24]，所以FICA试剂对油脂的检测限2.0 μg/100 mL，换算成国家标准单位20 μg/kg是合理的。参考高效液相色谱-荧光法测定地沟油中SDBS的检出限为1.0 mg/kg[17]，都能够可靠鉴定地沟油。本实验研发的通过检测油脂中SDBS的FIAC试剂，能够胜任鉴别地沟油的检测任务。

4 结 论

烷基苯磺酸相对分子量只有326.49，是只有免疫反应性而没有免疫原性的半抗原，而其免疫原性主要是“苯磺酸”基团。本研究应用改良活泼酯法合成突出“苯磺酸”基团的人工免疫原，免疫动物获得抗“苯磺酸”抗体。竞争ELISA实验证明抗体对含“苯磺酸基团”的化合物具有良好的亲和力，而对不含“苯磺酸基团”的化合物没有交叉反应性。以该抗体标记荧光微球，结合4-氨基苯磺酸合成的突出“苯磺酸”基团的抗原，制备了免疫荧光微球层析(FICA)试纸条，对SDBS标准品溶液的最低检测限为50 ng/mL，对添加SDBS油脂的最低检测限为20 μg/kg。本实验研发的通过检测油脂中SDBS的FIAC试剂，能够胜任鉴别地沟油的检测任务。