CYP1A1、TSLPR、CCR3在小儿特应性皮炎中的表达及与临床特征相关性研究

凌琬茗，刘 岩，谷红霞，赵瑞雪，韩志敏

(河北省儿童医院皮肤科，河北 石家庄 050031)

特应性皮炎属于一种慢性、炎症性、瘙痒性疾病，多发于婴幼儿期，且此病发病反复，多数患儿可持续至成年期，在临床上又被称为遗传过敏性皮炎、异位性皮炎、特应性湿疹、婴儿湿疹等，目前此病表现为逐年升高的趋势，且疾病迁延难愈、剧烈瘙痒在一定程度上影响患儿的正常生长发育[1-2]。研究显示，近年来我国小儿特应性皮炎的发病率表现为逐年升高的趋势，部分患儿在临床治疗中并未获得满意的效果，具有难以根治的特点，且目前对于小儿特应性皮炎的具体发病机制尚不完全明确，导致患儿疾病反复迁延，给患儿的身心带来了巨大的痛苦，因此深入分析小儿特应性皮炎的发病机制具有重要的作用[3-4]。本研究深入分析小儿特应性皮炎的发病机制，分析CYP1A1、TSLPR、CCR3在小儿特应性皮炎中的表达，为临床上此病的诊治提供新方向。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年5月—2020年5月我院收治的特应性皮炎患儿89例作为特应性皮炎组，男性42例，女性47例，年龄2.0～8.5岁，平均(4.99±2.83)岁，病程6个月～4.5年，平均(2.12±1.00)年，根据欧洲特应性皮炎评分(Scoring Atopic Dermatitis Index，SCORAD)标准评价患儿疾病严重程度，其中得分<25分为轻度(35例)、得分25～50分为中度(39例)、得分>50分为重度(15例)。同期选取行健康体检的健康儿童80例作为健康组，男性39例，女性41例，年龄2.3～8.6岁，平均(5.18±2.72)岁。两组纳入标准：①特应性皮炎组患儿均符合中华医学会皮肤性病学分会免疫学组,特应性皮炎协作研究中心所颁布的《中国特应性皮炎诊疗指南(2020版)》[5]中关于小儿特应性皮炎的诊断标准，②病程≥6个月，③近1周内未接受过疾病相关治疗者；④健康组研究对象无皮肤类疾病，近6个月内无感染，身体健康，无家族遗传史。排除标准：①心、肺、肾等重要脏器功能不全者；②先天性疾病者；③合并其他皮肤病或者感染性疾病者；④近1周内使用过免疫抑制剂、糖皮质激素、抗组胺药物干预者；⑤皮肤严重溃疡者；⑥精神障碍者。两组在性别、年龄、居住地等一般资料中比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较Table 1 Comparison of general information in two groups

所有患儿家属均知情同意本研究，且经医院伦理委员会审核批准。

1.2方法

1.2.1样本采集 采集两组入组后第2天空腹静脉血3 mL，在密度梯度离心处理下获得外周血单个核细胞，用于CYP1A1、TSLPR、CCR3测定。

1.2.2CYP1A1、TSLPR检测方法 采用实时荧光定量PCR测定CYP1A1、TSLPR表达量，取所制备的外周血单个核细胞加入600 μL RNA提取细胞裂解液，充分吹打混合均匀后备用，采用Trizol法提取单个核细胞总RNA，并测定所提取的RNA纯度、完整性，当所测得的A260/A280比值在1.8～2.1范围内、28S宽度为18S的1.5～2.0倍时说明所提取的RNA纯度、完整性较好可用于后续指标检测。采用实时荧光定量PCR法测定外周血单个核细胞中CYP1A1、TSLPR表达量，采用Takara逆转录试剂盒行逆转录获得cDNA，采用2-△△Ct方法计算CYP1A1、TSLPR表达量。反应体系(27 μL)：上下游引物各1.6 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 10.3 μL;SYB Green 12.5 μL。反应条件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 31 s，共进行40个循环。CYP1A1引物序列：正义链：5′-GTCATCTGT-GCCATTTGCTTTG-3′，反义链：5′-CAACCACC-TCCCCGAAATTATT-3′；TSLPR引物序列：正义链：5′-GCACACTGGCAATGTAATGC-3′，反义链：5′-GTTGAACAGAACAAGTGACC-3′；内参基因GAPDH引物序列：正义链：5′-AACAGCCTC-AAGATCATCAGCAA-3′，反义链：5′-GACTGT-GGTCATGAGTCCTTCCA-3′。

1.2.3CCR3检测方法 采用荧光抗体标记、流式细胞仪测定外周血单个核细胞中CCR3表达水平，将10 μL CCR3-FITC试剂加入至指标管中，之后在检测管中加入抗凝血100 μL，并设立同型对照管，振荡均匀后，在避光室温下进行孵育，孵育20 min。将2 mL溶血素加入，振荡均匀后在避光室温下进行孵育，孵育5 min，之后离心5 min(1 000 r/min)，将上清液弃除后加入2 mL PBS，再次离心5 min(1 000 r/min)，上清液弃除加入300 μL PBS混合均匀，使用美国BectonDickinso公司流式细胞仪检测CCR3表达水平，使用Cell Quest软件分别以FSC/SSC给细胞设门，获取门内10 000个细胞(每管)，分析CCR3表达水平。

1.3统计学方法 应用SPSS 25.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用t检验、F检验和SNK-q检验，计数资料比较采用χ2检验。相关性采用Pearson相关性分析，采用受试者特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析CYP1A1、TSLPR、CCR3对小儿特应性皮炎的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CYP1A1、TSLPR、CCR3在两组中的表达情况比较 与健康组比较，特应性皮炎组CYP1A1、TSLPR、CCR3表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 CYP1A1、TSLPR、CCR3在两组中的表达情况比较Table 2 Comparison of CYP1A1, TSLPR and CCR3 expressions between two groups

2.2CYP1A1、TSLPR、CCR3与不同临床特征组间的差异 CYP1A1、TSLPR、CCR3表达在特应性皮炎患儿性别、年龄、伴随症状组间差异无统计学意义(P>0.05)；CYP1A1、TSLPR、CCR3表达不同特应性皮炎患儿疾病严重程度、家族过敏史、特应性家族史、个人过敏史相关，与轻度、中度、无家族过敏史、无特应性家族史、无个人过敏史的患儿组间比较，重度、有家族过敏史、有特应性家族史、有个人过敏史的患儿组CYP1A1、TSLPR、CCR3表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同临床特征组间CYP1A1、TSLPR、CCR3表达的比较Table 3 Comparison of CYP1A1, TSLPR and CCR3 expressions among groups with different clinical characteristics

2.3CYP1A1、TSLPR、CCR3之间相关性分析 Pearson相关性分析显示，CYP1A1与TSLPR之间呈正相关(r=0.267,P=0.012)；CYP1A1与CCR3之间呈正相关(r=0.359,P=0.001)；TSLPR与CCR3之间呈正相关(r=0.269,P=0.011)。

2.4CYP1A1、TSLPR、CCR3对小儿特应性皮炎的预测价值分析 ROC曲线分析CYP1A1、TSLPR、CCR3对小儿特应性皮炎的预测价值结果显示，与CYP1A1、TSLPR、CCR3单项预测相比，三项联合的预测价值较高(P<0.05)。见表4、图1。

表4 CYP1A1、TSLPR、CCR3对小儿特应性皮炎的预测价值分析Table 4 Analysis of predictive value of CYP1A1, TSLPR and CCR3 in atopic dermatitis in children

图1 CYP1A1、TSLPR、CCR3预测小儿特应性皮炎的ROC曲线

3 讨 论

小儿特应性皮炎临床表现较为复杂，在疾病的不同时期其皮损表现不同，较为严重的表现为急性湿疹，多伴随着剧烈瘙痒，目前随着工业化的不断发展，小儿特应性皮炎的发病率逐年升高，严重影响着患儿的身心和生长发育[6-7]。

细胞色素酶P450属于一组含有铁血红素的超家族，其包含CYP1、CYP2、CYP3三大家族，属于外源性、内源性物质转化酶的主要成员，其中CYP1亚家族中的CYP1A1一直是目前所研究的热点，在一定的刺激下其可与体外的AHR发生特异性结合，使其表达升高，参与多种疾病的发生发展[8-9]。目前随着临床上对CYP1A1的不断深入研究发现，其参与多种生理病理过程，包括氧化应激、免疫反应、急慢性炎症、动脉粥样硬化、肺损伤、多种恶性肿瘤、病原体感染等[10-11]。本研究为分析CYP1A1是否与小儿特应性皮炎相关，采集此类患儿外周血单个核细胞，检测其表达，结果显示，CYP1A1在此病中表达明显升高，且与疾病严重程度、过敏史、特应性家族史等相关，此结果提示着，CYP1A1可能参与在内源性、外源性的刺激下参与此病，此结果与胡宇晴等[12]在其研究中发现，CYP1A1在特应性皮炎患者中表达升高的结果保持一致。

特应性皮炎皮肤炎症皮损处的特征表现为活化T细胞浸润，存在少量的嗜酸粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞和大量的CD4+记忆性T细胞，其中CD4+为辅助性Th细胞表面标志物，根据其所执行的功能不同分析三个亚型，即为Th0、Th1、Th2[13-14]。既往研究发现，Th1/Th2细胞失衡在特应性皮炎的发生中具有重要的作用，在疾病处于急性时期时Th1细胞被抑制，而Th2细胞占优势，TSL受体为Th2型细胞因子，其具有促进此类免疫应答反应的作用[15]。研究表明，TSLP属于启动过敏反应的重要因子，TSLPR为其受体，主要在某些T细胞表面、单核细胞、树突状细胞上所表达，其主要在树突状细胞极化促进Th2型细胞因子产生的过程中发挥着重要的作用[16-17]。另外有研究发现，趋化因子与白细胞募集浸润炎症皮损相关，而Th1、Th2细胞表达分化趋化性细胞因子受体，CCR3、CCR4、CCR8主要在Th2细胞上选择性表达，均为上述细胞的表面标志物[18]。CCR3属于G蛋白藕联受体家族成员之一，其主要被CCR3基因所编码，属于C-C型趋化因子受体，CCR3可经过与包括CCL11、CCL7、CCL13、CCL5等在内的多种配体产生结合作用发挥其不同的生物效应，其中与CCL11的亲和力最强[19-20]。临床研究显示，CCR3主要经过与CCL11的特异性结合作用募集并活化嗜酸粒细胞，参与变应性疾病的发生发展[21-22]。本研究结果显示，TSLPR、CCR3在小儿特应性皮炎中表达明显升高，且与患儿疾病严重程度、过敏史等临床特征密切相关，此结果提示着TSLPR、CCR3可能在Th1、Th2细胞表达异常的情况下参与此病的发生进展，但本研究并未深入探讨其具体作用机制，还需后续研究进一步分析证实，为临床上此病的早期诊断提供参考。

本研究分析CYP1A1、TSLPR、CCR3三者呈相关性，并采用ROC曲线分析CYP1A1、TSLPR、CCR3对小儿特应性皮炎的预测价值，结果显示，三者正相关，且与三项单独预测相比，三项联合对小儿特应性皮炎的预测价值较高，提示着临床上可采用三者联合评估此病，以早期预测，并采取针对性的措施干预，降低发病率，促进患儿疾病恢复。

综上所述， CYP1A1、TSLPR、CCR3在小儿特应性皮炎中表达升高，且与患儿疾病严重程度、家族过敏史、特应性家族史、个人过敏史相关，随着患儿疾病严重程度的增加，表达加剧，且与单项预测相比，三项联合预测小儿特应性皮炎的价值较高。