变应性鼻炎患者miR-326、miR-155表达及甲基化干预研究①

姜孝芳 贾宏林 梁晓鹰 张 茹 高 丽 杨 清（新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐 830000）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由免疫球蛋白（IgE）介导、鼻黏膜嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）浸润和Th2细胞因子分泌增加的鼻黏膜Ⅰ型变应性炎症性疾病，主要症状为鼻痒、鼻塞、流涕、打喷嚏，全球患病率逐年上升，影响了全球10%～40%成年人和2%～25%儿童，是世界范围内常见的变应性疾病，严重影响人们生活质量［1-3］。新疆是多民族聚集地，地处西北，干燥少雨，冷热变化悬殊，特殊的地理环境及气候致使AR成为新疆地区的常见病和多发病［4］。本课题组在南、北疆及乌鲁木齐调查发现，乌鲁木齐汉族AR患病率（33.36%）高于维吾尔族（19.19%），喀什、伊犁地区汉族AR患病率（26.1%）高于维吾尔族（12.8%），新疆维、汉民族患病率存在明显差异［5］。维吾尔族为新疆常住民族，推测可随环境压力改变的基因表观遗传学差异与维吾尔族AR患病率较低有关。Th1和Th2细胞间免疫应答失衡是AR的免疫学基础。正常状态下，Th1和Th2细胞均维持免疫稳态，当AR发作时会出现Th1细胞应答抑制，Th2细胞应答亢进，即“Th2＞Th1免疫应答”。

microRNA（miRNA）是一种小的非编码单链RNA分子，含20～25个核苷酸，在进化过程中高度保守，能够靶向动植物中的RNA，阻止蛋白翻译或降解mRNA，参与转录后基因表达调控［6-8］。miRNA与变应性疾病的关系密不可分，参与信号转导、细胞增殖、分化及凋亡等过程［9］。本研究采用RT-PCR检测AR患者miR-155、miR-326及IL-2、IL-4、IFN-γ mRNA表达，在动物及细胞水平研究甲基化干预对miR-155、miR-326及Th细胞因子的影响，探讨其在疾病发生发展中的作用，为新疆维吾尔族、汉族AR患者提供新的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象选取2013年12月至2017年11月在新疆医科大学第一附属医院和新疆维吾尔自治区中医医院确诊为AR发作期的患者85例（鼻炎组），平均年龄（22.69±3.81）岁，其中维吾尔族32例，汉族53例，男39例，女46例，均在当地居住5年以上，并排除COPD、过敏性皮炎、高血压、糖尿病、孕妇及60岁以上患者。纳入标准：均符合2009年中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会、鼻科学组武夷山会议变应性鼻炎诊治原则和推荐方案［10］；对照组选择同期在新疆医科大学第一附属医院及新疆维吾尔自治区中医医院的健康体检者、新疆医科大学健康志愿者97例，平均年龄（21.08±3.88）岁，其中维吾尔族40例，汉族57例，男50例，女47例，既往无哮喘病史、过敏性疾病史及心血管疾病史，体检均正常。本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（20170214-185），所有受试者知情同意。

1.1.2 实验动物SPF级SD雄性大鼠，体质量180～220 g，由新疆医科大学动物实验中心提供，并在新疆医科大学清洁屏障内饲养。随机分为3组：正常组、模型组、5-Aza组，每组10只。

1.1.3 主要试剂与仪器Jurkat细胞株（人外周血白血病T细胞）购自中科院细胞库；5-Aza（A2385）、淋巴细胞分离液10771（RNBF2219）购自美国Sigma公司；磁珠抗体（557787）购自BD公司；TRIzol裂解液购自Lifetechnologies公司；逆转录试剂盒miScriptⅡRT Kit（218161）、荧光定量试剂盒miScript SYBR Green PCR kit（1046470）购自凯杰公司；Hs-miR-155 miScript Primer Assay（MS00008778）、Hs-miR-326 miScript Primer Assay（MS00003948）、Rn-miR-326 miScript Primer Assay（MS00027342）购 自QIAGEN公司；胎牛血清购自BI公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；IFN-γ抗体（BM4939，1∶500稀释）购自Affinity公司；GAPDH抗体（ab8245，1∶10 000稀释）购自Abcam公司；荧光定量RT-PCR仪购自ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及CD4+T细胞分离无菌条件下取外周血4～5 ml，采用淋巴细胞分离液10771进行淋巴细胞分离，分离的淋巴细胞加入500µl RPMI 1640培养液，同时加入45µl磁珠抗体，混匀，分离CD4+T淋巴细胞，封口膜封存，-80℃液氮中冻存。

1.2.2 造模及干预采用经典卵清蛋白致敏法构建动物模型，模型组采用30 mg卵清蛋白作为抗原，氢氧化铝粉末3 g作为佐剂，加入100 ml生理盐水制备混悬液，腹腔注射（1 ml/只），隔天1次，共7次，为基础致敏。基础致敏次日采用5%卵清蛋白（生理盐水溶解）攻击双侧鼻腔，50µl/侧，1次/d，共10次。空白对照组采用等量生理盐水代替卵清蛋白及氢氧化铝腹腔注射和滴鼻攻击，方法同上。给予5-Aza（5 mg/kg），连续7 d，每次给药前30 min进行滴鼻，干预结束后禁食12 h，2%戊巴比妥麻醉，取鼻黏膜。

1.2.3 细胞培养正常培养Jurkat细胞，待细胞达到80%～90%融合时，收集细胞悬液，计数，接种至6孔板，细胞密度为5×105个/孔。待细胞生长至对数生长期时，给予5-Aza干预，继续孵育24 h，分别收取RNA及蛋白。

1.2.4 RNA提取TRIzol法提取总RNA，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 miRNA逆转录及cDNA合成加入1µg总RNA模板，逆转录试剂与总RNA为10µl，严格按照逆转录试剂盒说明书操作。

1.2.6 RT-qPCR检测miR-326、miR-155、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达参照荧光定量试剂盒miScript SYBR Green PCR kit说明书，60℃退火，45个循环，采用荧光定量RT-PCR仪进行RT-qPCR实验。引物序列：GAPDH正向引物5"-GACCTGACCTGCCGCTA-3"，反向 引 物5"-AGGAGGGGTGTCGCTGT-3"；IL-2正向引物5"-GCAACCCTGTCTTCATTG-3"，反向引物5"-TCTGGTGAGTTGGGATTC-3"；IL-4正向引物5"-AGCAGTCCACAGGCACAAG-3"，反向引物5"-CTGGGTGGCTTCCTTCACAG-3"；IFN-γ正向引物5"-AACTTAAAGATGACAGAGATCC-3"，反向引物5"-TCTGGTGAGTTGGGATTC-3"，以上引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。2-ΔΔCt计算相对表达。

1.2.7 Western blot检测IFN-γ蛋白表达取蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜3次，5 min/次，加入一抗4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，10 min/次，二抗室温摇床封闭1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，显影曝光，Image J软件进行灰度定量分析。

1.3 统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计分析，数据以±s表示，采用独立样本t检验进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻炎组与正常组miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达RT-qPCR结果显示，与正常组相比，鼻炎组miR-155、miR-326表达升高（P＜0.05），分别是正常组的1.66、2.69倍；IFN-γ表达下降（P＜0.05），是正常组的0.59倍（表1）。

2.2 维吾尔族、汉族鼻炎组相关基因表达维吾尔 族 与 汉 族miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γ mRNA基因表达差异均无统计学意义（P＞0.05），但维吾尔族患者Th2细胞因子IL-4表达低于汉族患者，是汉族患者的0.51倍（表2）。

2.3 维吾尔族、汉族正常组相关基因表达正常组维吾尔族miR-326表达是汉族的3.6倍，IL-4是汉族的0.53倍（P＜0.05，表3）。

2.4 鼻炎组miR-326与IFN-γ表达相关性分析Spearman相关性分析显示，鼻炎患者miR-155、miR-326表 达 与IFN-γ表 达 呈 负 相 关（r=-0.205，r=-0.225，P=0.005，P=0.002）。

2.5 miRNA在动物模型鼻黏膜中的表达AR患者外周血CD4+T淋巴细胞miR-326、miR-155表达存在差异，与IFN-γ表达呈负相关，其中AR患者miR-326表达是正常组的2倍以上，且与IFN-γ表达呈负相关。为研究其在鼻黏膜中的表达及与甲基化的关系，本研究以甲基化酶抑制剂5-Aza干预AR大鼠模型，检测大鼠鼻黏膜中miR-326、IFN-γ表达，发现模型组miR-326表达升高，干预后表达下降，但差异无统计学意义，模型组IFN-γ表达显著下降，甲基化酶抑制剂干预后其表达显著提高（表4）。

表1 鼻炎组和正常组miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达（±s）Tab.1 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin rhinitis group and normal group（±s）

表1 鼻炎组和正常组miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达（±s）Tab.1 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin rhinitis group and normal group（±s）

GroupsnmiR-155miR-326IL-2IL-4IFN-γ AR（△CT）856.68±1.285.93±1.079.53±3.3310.79±2.369.01±2.35 Norma（l△CT）977.41±1.987.36±2.319.43±3.8410.69±2.018.25±2.29 AR/Norma（l2-ΔΔCt）1.662.690.930.950.59 t 2.8985.249-0.179-0.288-2.195 P 0.0040.0000.8570.7740.029

表2 维吾尔、汉族鼻炎组miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达（±s）Tab.2 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin Uygur and Han rhinitis groups（±s）

表2 维吾尔、汉族鼻炎组miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达（±s）Tab.2 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin Uygur and Han rhinitis groups（±s）

GroupsnmiR-155miR-326IL-2IL-4IFN-γ Han（△CT）Uygur（△CT）Uygur/Han（2-ΔΔCt）t P 53 32 6.84±1.31 6.43±1.23 1.33 1.423 0.158 5.95±1.06 5.89±1.10 1.04 0.253 0.798 9.42±3.53 9.70±3.01 0.82-0.382 0.703 10.42±2.30 11.39±2.37 0.51-1.859 0.067 8.97±2.68 9.01±1.72 0.97-0.165 0.870

表3 维、汉民族正常组miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达（±s）Tab.3 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin normal group of Uggur and Han nationality（±s）

表3 维、汉民族正常组miR-155、miR-326、IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表达（±s）Tab.3 mRNA expressions of miR-155，miR-326，IL-2，IL-4 and IFN-γin normal group of Uggur and Han nationality（±s）

Groups Han（△CT）Uygur（△CT）Uygur/Han（2-ΔΔCt）t P n 56 41 miR-155 7.63±2.27 7.11±1.46 1.43 1.272 0.206 miR-326 8.14±2.55 6.29±1.36 3.60 4.230 0.000 IL-2 9.65±4.66 9.13±2.33 1.43 0.656 0.513 IL-4 10.31±1.98 11.22±1.96 0.53-2.262 0.026 IFN-γ 7.96±2.56 8.65±1.82 0.61-1.481 0.142

表4 5-Aza干预AR大鼠模型miR-326及IFN-γmRNA表达（±s）Tab.4 mRNA expressions of miR-326 and IFN-γin AR rat model after 5-Aza intervention（±s）

表4 5-Aza干预AR大鼠模型miR-326及IFN-γmRNA表达（±s）Tab.4 mRNA expressions of miR-326 and IFN-γin AR rat model after 5-Aza intervention（±s）

Note：1）P＜0.05 vs normal group.

Groups Normal AR 5-Aza intervention miR-326 1.04±0.42 1.28±0.91 1.06±0.65 IFN-γ 1.02±0.24 0.22±0.061）1.36±0.17

表5 5-Aza干预后Jurkat细胞miR-326、miR-155及IFN-γ mRNA、蛋白表达（±s）Tab.5 mRNA and protein expressions of miR-326，miR-155 and IFN-γin Jurkat cells after 5-Aza intervention（±s）

表5 5-Aza干预后Jurkat细胞miR-326、miR-155及IFN-γ mRNA、蛋白表达（±s）Tab.5 mRNA and protein expressions of miR-326，miR-155 and IFN-γin Jurkat cells after 5-Aza intervention（±s）

Note：1）P＜0.05，2）P＜0.01 vs normal group.

Groups Normal 5-Aza（0.25µm/ml）5-Aza（1µm/ml）miR-326 1.04±0.34 1.96±0.401）1.34±0.33 miR-155 1.05±0.40 4.30±2.012）2.22±0.82 IFN-γ mRNA 1.00±0.11 1.34±0.21 1.55±0.321）IFN-γ protein 1.09±0.16 0.45±0.042）0.89±0.09

2.6 Jurkat细 胞miR-326表 达 为探讨miR-326差异表达及甲基化干预在鼻黏膜和T细胞中的作用，本研究以甲基化酶抑制剂5-Aza干预外周血Jurkat细胞，检测miR-326及IFN-γ表达，发现甲基化酶抑制剂干预后miR-326表达呈上升趋势，随着甲基化酶抑制剂干预浓度上升而下降；IFN-γmRNA表达略有上升，但其蛋白表达下降，这种下降趋势随着甲基化酶抑制剂干预浓度上升有所减弱，说明甲基化酶抑制剂干预可上调miR-326及IFN-γmRNA表达，下调IFN-γ蛋白表达。5-Aza（0.25µm/ml）干预组中，miR-326表达上调时，IFN-γ蛋白表达明显下降，5-Aza（1µm/ml）组，miR-326表达下降时，IFN-γ蛋白表达上升，与课题组在鼻炎患者中发现miR-326表达与IFN-γ呈负相关结论一致。5-Aza干预后，Jurkat细胞IFN-γmRNA表达略有上升与其蛋白表达下降结论相反，提示5-Aza干预后存在转录后修饰（表5、图1）。

图1 5-Aza干预后Jurkat细胞miR-326、miR-155及IFN-γ mRNA、蛋白表达Fig.1 Expressions of miR-326，miR-155，IFN-γmRNA and protein in Jurkat cells interfered by 5-Aza

3 讨论

AR是特定个体接触抗原后，在多种炎症因子趋化作用下，以Th2型免疫应答为基础的变应性炎症性疾病，是目前世界上常见的非传染性慢性上呼吸道疾病之一［11］。T细胞在免疫应答中具有重要作用，按照CD分子表达不同可分为CD3+、CD4+、CD8+T细胞。CD4+T细胞也称T辅助细胞（T helper cell，Th），可协调免疫应答并参与细胞活化信号传递。根据Th0分泌的细胞因子不同，Th细胞可分为Th1、Th2、Th17及调节性T细胞（Treg）4个亚群。Th1参与细胞免疫，主要分泌IL-2、IL-12及IFN-γ等细胞因子，抑制Th2类细胞特征因子产生；Th2参与体液免疫，主要分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等细胞因子，IL-4是特异性细胞因子，诱导IgE生成及嗜酸性细胞、肥大细胞成熟。正常情况下，Th1/Th2类细胞因子互相依存和制约，保持动态平衡，当机体受到外来异常抗原刺激时，上述平衡被打破，Th1、Th2细胞中Th2亚群功能升高，Th1亚群功能降低，引起异常免疫应答。本研究中鼻炎组Th1细胞因子IFN-γ mRNA表达低于对照组（P＜0.05），但Il-2及IL-4表达差异无统计学意义，说明在本研究病例中Th1/Th2细胞平衡失调主要表现为Th1亚群功能降低。鼻炎组及正常组维吾尔族IL-4 mRNA表达是汉族的0.51和0.53倍（P＜0.05），其余各基因表达差异均无统计学意义，提示IL-4在维吾尔族正常人群低表达可能是其AR患病率低的因素之一。

研究表明，差异表达的miRNA及其靶基因功能包括参与氧化应激反应、释放炎症递质、免疫细胞功能和反应调控等［12］。miRNA在AR中表现出特定特征，具有重要调控作用［13］。miR-155目前研究较多，在适应性免疫细胞（包括效应T细胞亚群）发育和激活中发挥作用，参与造血细胞分化、免疫、血管重塑以及炎症信号通路等调控，被认为参与AR发病［11，14］。鼻炎组miR-155表 达高于对照组（P＜0.05），与艾宏辉等［15］在鼻炎中的研究结论一致，miR-155影响CD4+T细胞向Th1/Th2细胞分化的平衡，miR-155缺乏将引起Th1细胞分化受阻，Th2细胞诱导增加［16］。本研究也发现AR组miR-155呈高表达，IFN-γ呈低表达，且二者呈负相关。

miR-326差异表达在AR中的研究较少，但与肿瘤、免疫系统疾病密切相关［17-18］。鼻炎组外周血CD4+T细胞miR-326表达是对照组的2.69倍，差异有统计学意义（P＜0.05），与IFN-γmRNA表达呈负相关（P＜0.05）。正常组中维吾尔族miR-326水平是汉族的3.5倍（P＜0.05），提示miR-326在AR发病机制中可能起重要调控作用。自身免疫性疾病研究发现，miR-326表达与Treg/Th17有关，可促进Th17细胞分化，导致炎症发生［19-20］。鼻炎组CD4+T细胞miR-326高表达，在正常组维吾尔族表达高于汉族，且与IFN-γ呈负相关。为进一步研究这种表达差异与甲基化的关系，本研究以甲基化酶抑制剂5-Aza干预AR模型大鼠，检测大鼠鼻黏膜miR-326、INF-γ表达，发现模型组miR-326表达上升，与在人群中研究一致，但这种增高趋势随着甲基化酶抑制剂干预后下降，模型组IFN-γ表达显著下降（P＜0.05），甲基化酶抑制剂干预后其表达显著提高。甲基化酶抑制剂干预培养的淋巴细胞后，miR-326表达呈上升趋势，但随着甲基化酶抑制剂干预浓度上升而下降；IFN-γ蛋白表达下降，这种下降趋势随着甲基化酶抑制剂干预浓度上升有所减弱，说明甲基化酶抑制剂干预可上调miR-326及IFN-γmRNA表达，下调IFN-γ蛋白表达。本研究分别在人、动物模型及培养的外周血淋巴细胞中检测了miR-326表达，分析甲基化酶抑制剂干预对其的影响，结果显示miR-326在鼻炎患者外周血CD4+T高表达，甲基化酶抑制剂干预Jurkat细胞后miR-326表达呈上升趋势，AR模型中也发现miR-326在大鼠鼻黏膜中表达上升，与在患者外周血淋巴细胞中的研究一致。

综上，新疆维吾尔族鼻炎患病率低于汉族，这种差异可能受长期环境因素与表观遗传学（如miRNA表达及甲基化等改变）有关，表现为维吾尔族人群miR-326高表达与IL-4低表达，病例组IFN-γ呈低表达，甲基化干预可调控T细胞miR-326及IFN-γ表达，但在鼻黏膜差异无统计学意义。miR-326表达与IFN-γmRNA表达呈负相关，提示miR-326可能通过影响Th2细胞因子产生导致Th1/Th2失衡，最终导致AR发生。AR发病率逐年升高，新疆汉族鼻炎患病率高于维吾尔族，严重影响患者日常生活及学习，本研究显示新疆维吾尔族和汉族AR患者miR-326高表达主要发生于CD4+T淋巴细胞，这种高表达的机制有待进一步研究。