TLR2/4、NOD1/2受体在ETEC感染猪肠道上皮细胞炎性反应中作用的研究

李雪滢，韩阳春，黄 静，李 霞，曾 聪，肖 乐，刘峻源，曾雯玉，彭远义*，王自力

（1.西南大学动物医学院，重庆 北碚 400715；2.浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310030）

断奶仔猪生长速度较快、饲料转化率最高，处于快速生长发育时期[1]。然而，断奶后由于仔猪发育不全，肠道内微生态环境不够稳定，常因断奶应激造成产肠毒素大肠杆菌（ETEC）等病原菌感染而发生断奶腹泻（PWD）[2-4]。研究表明，ETEC 可黏附在猪小肠上皮，分泌肠毒素，使电解质和水分过多分泌到肠腔中造成严重腹泻，引起宿主一系列免疫反应，导致仔猪严重的肠道炎性反应和饲料转化率降低[5]。还有研究表明，携带F4+菌毛的ETEC 通过与受体结合可特异性黏附到猪肠道上皮细胞IPECJ2，并诱导细胞发生炎性反应[6-8]。同时，宿主细胞中的模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRR）在抗感染和固有免疫过程中有重要作用，其中Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）和核苷酸结合寡聚结构域样受体（NOD 样受体也即Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR）分别作为胞外和胞内模式受体在病原菌感染中发挥重要作用[9]，如TLR2 和TLR4 均可通过特异性识别病原菌向细胞内传递信号，激活核因子，致促炎性细胞因子基因的转录，进而诱发一系列炎症反应；而NOD 样受体是一类胞浆内的免疫模式识别受体，如NOD1 和NOD2 可通过与配体结合后，与受体相互作用蛋白2（Receptor interacting protein 2，RIP2）作用磷酸化IκB，进而激活转录因子NF-κB，介导炎症介质的表达[10]。研究表明，ETEC 可诱导小鼠回肠细胞NOD2 受 体、RIP2、TGE-β 激 活 的 激 酶1（TAK1）mRNA 转录水平的升高，并可提高NF-κB p65 蛋白的表达水平[11]。

为了明确ETEC 感染IPEC-J2 后TLR2/4、NOD1/2 受体及其下游促炎性细胞因子的转录水平，并探究TLR2/4、NOD1/2 在ETEC 感 染IPEC-J2 中 的 作用，本研究采用F4+ETEC 感染IPEC-J2，检测ETEC感染IPEC-J2 后TLR2/4、NOD1/2 细胞受体及相关促炎性细胞因子mRNA 转录水平的变化，为ETEC 诱导的TLR2/4 及NOD1/2 受体的作用机制研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料ETEC CVCC196 株、O8:H19:K88ac 购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。猪肠道上皮细胞（IPEC-J2）由本实验室保存。

DMEM/F12 培 养 基（11330-057）、胎 牛 血 清（1315148）、0.25%胰蛋白酶（1572281）均购自美国GIBCO 公司；PBS（BF-0011）购自北京鼎国昌盛生物公司；Total RNA Isolation Kit（RC101）、HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（R323-01）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711-02）均购自南京诺唯赞公司；MTT（Lot#2464C186）购自美国Sigma 公司；TLR2/4 受体混合抑制剂AMG-9810（S6934）、NOD1/2 受体混合抑制剂NOD-IN-1（S0004）购自Selleck公司。

1.2 ETEC 感染IPEC-J2 后细胞活力的检测将IPEC-J2 按5×104个/mL 铺 于96 孔 细 胞 培 养 板 中，于37 ℃、5% CO2过夜培养后，分别按MOI 0.1、0.02、0.01 比例向各孔内加入10 μL、50 μL、100 μL 1×107cfu/mL ETEC菌液，并加入100 μL无血清及双抗的DMEM/F12 基础培养基作为感染组，设不加ETEC菌液，只加100 μL无血清及双抗的DMEM/F12基础培养基的IPEC-J2 为阴性对照组；以含DMEM/F12 基础培养基，但不含细胞的培养孔为空白对照组。每组3 个重复。于37 ℃、5% CO2培养2 h 后，采用MTT法[12]检测ETEC感染IPEC-J2后的细胞活力。细胞活力（%）=（感染组OD490nm平均值-空白对照组OD490nm平均值）/（阴性对照组OD490nm平均值-空白对照组OD490nm平均值）×100%；利用Graphpad prism 7.0软件计算ETEC感染IPEC-J2 后的细胞活力，从而确定ETEC 感染IPEC-J2 细胞增殖的半数抑制浓度（IC50）（即ETEC 感染致IPEC-J2 细胞活力达到50%时的浓度）。

1.3 ETEC 感染对IPEC-J2 中的TLR2/4、NOD1/2及相关细胞因子转录水平影响的检测按照1.2 的方式将IPEC-J2 铺板、培养。根据1.2 的结果，感染组（ETEC 组）各孔按最优MOI 0.01 加入500 μL ETEC菌液（不含血清及双抗），对照组（CON 组）仅加入不含血清及双抗的DMEM/F12 基础培养基，每组3 个重复，于37 ℃、5% CO2中分别培养30 min、60 min、105 min 和120 min（预试验结果显示，这几个时间点IPEC-J2 中细胞因子转录水平差异较显著），之后弃掉上清液收集孔内细胞。根据GenBank 中猪TLR2、TLR4、NOD1、NOD2 基因序列，利用Primer 5 软件设计引物（表1）。采用Total RNA Isolation Kit 提取细胞总RNA，反转录为cDNA 后作为模板，采用表1中的引物，经荧光定量PCR（qPCR）检测上述各基因的转录水平，采用2ΔΔCt法计算各基因的相对转录水平。相对转录水平=2ΔΔCt，ΔΔCt=实验组（目的基因Ct 值-内参基因Ct 值）-对照组（目的基因Ct 值-内参基因Ct 值）。

表1 目的基因扩增的引物信息Table 1 Primer sequence of target gene amplification

1.4 TLR2/4 及NOD1/2 受体抑制剂对ETEC 感染的IPEC-J2 中TLR2/4、NOD1/2 及相关细胞因子转录水平影响的检测向12 孔板培养的IPEC-J2 中分别加入500 μL 5 μmol/L TLR2/4 受体混合抑制剂AMG-9810、10 μmol/L NOD1/2 受体混合抑制剂NOD-IN-1，各6 个重复。置于37 ℃、5% CO2预先作用6 h，弃培养基后，从上述各组中各选3 个孔按照MOI 0.01加入1 mL（1×107cfu/mL）ETEC 菌悬液，于37 ℃、5%CO2培养2 h。设无抑制剂和ETEC 的细胞为对照组（CON 组），无抑制剂但感染ETEC 的细胞为感染组（ETEC 组），添加抑制剂但不感染ETEC 的细胞为对照+抑制剂组（CON+IN 组），既添加抑制剂又感染ETEC 的细胞为感染+抑制剂组（ETEC+IN 组）。之后收获各组细胞，参照1.3 方法，经qPCR 检测IPEC-J2 TLR2/4、NOD1/2、IL-6、IL-8 及TNF-α mRNA 的转录水平，采用2ΔΔCt法计算各基因的相对转录水平。

1.5 数据的分析及处理实验数据均以平均值±标准差（-x±s）形式表示，利用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）并对数据进行统计学分析，*：P＜0.05 表示差异显著，**：P＜0.01 及***：P＜0.001 表示差异极显著；采用Graphpad prism 7.0 软件绘图。

2 结 果

2.1 不同浓度ETEC 感染对IPEC-J2 活力影响的检测结果分别按MOI 0.1、0.02 及0.01 的比例将ETEC 菌悬液加入IPEC-J2 2 h 后，通过MTT 法分析不同浓度ETEC 感染对IPEC-J2 活力的影响及测定IC50。结果显示，IPEC-J2 经不同MOI 的ETEC 感染2 h 后，根据测得的OD490nm值计算得到各组细胞的活力。结果显示，当ETEC 的MOI 为0.01 时，IPEC-J2的活力极显著低于CON组（P＜0.001），可达到IPEC-J2的半数抑制浓度IC50（1×107cfu/mL 1 mL ETEC 菌悬液）；而当MOI为0.1及0.02时，IPEC-J2的活力与CON组无显著差异（P＞0.05）（图1）。因此采用MOI 0.01、感染时间为2 h作为ETEC 感染IPEC-J2 的最适条件。

图1 不同浓度ETEC感染对IPEC-J2活力影响的检测结果Fig.1 Effect of ETEC at different concentrations on porcine intestinal epithelial cells

2.2 ETEC 感 染 后 对IPEC-J2 中TLR2/4 及NOD1/2转录水平的检测结果按MOI 0.01 将ETEC 菌液加入IPEC-J2中分别作用不同时间后，经qPCR检测细胞中TLR2、TLR4、NOD1、NOD2 受体的转录水平。结果显示，与CON 组相比，ETEC 感染的IPEC-J2 TLR2 受体mRNA 转录水平在感染后30 min 和120 min 时均极显著升高（P＜0.01、P＜0.001），其余时间段二者无显著差异；IPEC-J2 TLR4 受体mRNA 转录水平在感染后105 min 及120 min 均极显著升高（P＜0.01），其余时间段均与CON 组无显著差异。与CON 组相比，IPEC-J2 NOD1受体mRNA转录水平在感染后60 min开始极显著升高（P＜0.001），于120 min 时达到峰值；NOD2 受体mRNA 转录水平在感染后30 min～120 min时均极显著升高（P＜0.01）（图2）。上述结果表明，ETEC 感染IPEC-J2 后可分别于不同时间促进胞外受体TLR2/4 及胞内受体NOD1/2 mRNA 的转录水平。

图2 ETEC感染IPEC-J2后不同时间TLR2/4、NOD1/2受体mRNA转录水平的检测结果Fig.2 The transcription level of TLR2/4 and NOD1/2 in IPEC-J2 infected with ETEC at different times

2.3 ETEC 感染IPEC-J2 后促炎性细胞因子转录水平的检测结果按MOI 0.01 将ETEC 菌液感染IPECJ2 后30 min、60 min、105 min 和120 min，分 别 经qPCR 法检测其中的促炎性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α 的转录水平。结果显示，与CON 组相比，ETEC 感染后30 min～120 min，IPEC-J2 中TNF-α 的转录水平均极显著升高（P＜0.001），而IL-6、IL-8的转录水平在感染后60 min、105 min、120 min时均极显著高于CON 组（P＜0.01、P＜0.001），感染30 min 时则与CON组无显著差异（P＞0.05）（图3）。上述结果表明ETEC 诱导IPEC-J2 发生了炎性反应。

图3 ETEC感染IPEC-J2不同时间后IL-6、IL-8、TNF-α mRNA转录水平的检测结果Fig.3 The mRNA transcription levels of IL-6，IL-8 and TNF-α in IPEC-J2 infected with ETEC at different times

2.4 TLR2/4 受体抑制剂对ETEC 感染IPEC-J2 中的TLR2/4及细胞因子转录水平影响的检测结果IPECJ2 经TLR2/4 受体混合抑制剂AMG-9810 作用6 h 后 以MOI 0.01 感 染ETEC 菌 液，2 h 后经qPCR 检测细胞 中TLR2/4 受体及细胞因子的转录水平。结果显示，与CON组相比，与TLR2/4混合抑制剂AMG-9810作用6 h后，CON+IN 组IPEC-J2 中的TLR2 mRNA 转录水平显著降低（P＜0.05），TLR4 mRNA 转录水平极显著降低（P＜0.01）；再经ETEC 感染2 h 后，与ETEC 组相比，ETEC+IN 组IPEC-J2 中的TLR2 转录水平极显著降低（P＜0.01），TLR4转录水平显著降低（P＜0.05）（图4）。

图4 AMG-9810抑制剂对IPEC-J2中TLR2/4 mRNA转录水平影响的检测结果Fig.4 Effect of inhibitor AMG-9810 on transcriptional level of TLR2/4 in porcine intestinal epithelial cells

细胞因子转录水平检测结果显示，TLR2/4转录水平显著降低后，ETEC+IN 组下游促炎性细胞因子IL-6、IL-8 和TNF-α 转录水平与ETEC 组相比均极显著降低（P＜0.01、P＜0.001）（图5）。

图5 AMG-9810抑制剂对IPEC-J2中细胞因子mRNA转录水平影响的检测结果Fig.5 Effect of inhibitor AMG-9810 on transcriptional level of some cytokines in porcine intestinal epithelial cells

上述结果进一步表明ETEC 感染IPEC-J2 后可以激活其胞外受体TLR2/4，从而诱导下游炎性细胞因子的转录。

2.5 NOD1/2 受体抑制剂对ETEC 感染IPEC-J2 中NOD1/2 及细胞因子转录水平影响的检测结果添加500 μL浓度为10 μmol/L的NOD1/2混合抑制剂NODIN-1与IPEC-J2作用6 h后，经qPCR检测NOD1/2的转录水平，结果显示，IPEC-J2 经抑制剂作用6 h 后，CON+IN组的NOD1 mRNA转录水平与CON组相比极显著降低（P＜0.001），NOD2 mRNA 转录水平与CON 组相比显著降低（P＜0.05）；再经ETEC感染后，ETEC+IN组的NOD1 mRNA 转录水平与ETEC 组相比极显著降低（P＜0.001），NOD2 mRNA 转录水平与ETEC 组相比显著降低（P＜0.05）（图6）。

图6 NOD-IN-1抑制剂对IPEC-J2中NOD1/2 mRNA转录水平影响的检测结果Fig.6 Effect of inhibitor NOD-IN-1 on transcriptional level of NOD1/2 in porcine intestinal epithelial cells

细胞因子转录水平检测结果显示，NOD1/2受体转录水平被抑制后，ETEC+IN 组下游促炎性细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α转录水平与ETEC组相比均极显著降低（P＜0.001）（图7）。

图7 NOD-IN-1抑制剂对IPEC-J2细胞中因子转录水平影响的检测结果Fig.7 Effect of inhibitor NOD-IN-1 on transcriptional level of some cytokines in porcine intestinal epithelial cells

上述结果进一步表明ETEC 感染IPEC-J2 后可以激活其胞内受体NOD1/2，进而诱导下游炎性细胞因子的转录。

3 讨 论

现有研究表明，IL-6、IL-8 及TNF-α 均为促炎性细胞因子，可诱导组织细胞严重的炎性反应。其中，IL-6 引起细胞的急性期反应，且通过终末期B细胞的分化，免疫球蛋白的分泌和T 细胞的活化而导致特异性细胞和体液免疫反应[13]；IL-8 具有多种促炎作用，包括促进中性粒细胞粘附、趋化和溶酶体的排出[14-16]；TNF-α 能够促进多种细胞增殖或发出凋亡信号，在炎症和免疫反应中起核心作用[17]。此外，ETEC 感染可引起猪肠道组织的促炎性细胞因子（如TNF-α 和IL-6）的过度产生，从而降低紧密连接蛋白（Tight junction，TJ）的表达并损害肠道的完整性[18]。本研究结果也显示，随着ETEC感染时间的延长，IPECJ2中的TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA 转录水平均呈极显著升高，表明ETEC诱导细胞发生了炎性反应。

肠上皮细胞（IEC）存在病原体的专门模式受体（PRR），如膜结合的TLR 和NLR[19]。其中，TLR4 是巨噬细胞的重要PRR，在炎症过程中起关键作用[20-21]。有研究表明，经LPS作用后，TLR4随后激活其下游信号，包括细胞外信号调节激酶（ERK）1/2[22]、MyD88/NF-κB/MAPK[23]和PI3K/Akt，从而导致炎性细胞因子的产生；NODs 样受体N 端的半胱天冬酶募集结构域（CARD）也可结合并激活受体作用蛋白2（RIP2），使IκB 磷酸化，最终均激活转录因子NF-κB，通过NFκB和MAPK信号通路介导下游炎性细胞因子的表达[24]。

本研究结果显示，ETEC 感染IPEC-J2 后不同时间TLR2/4 受体转录水平均极显著升高；NOD1 受体转录水平在感染后60 min 也极显著升高，且于120 min时达峰值，而NOD2 受体转录水平于感染后30 min即达到峰值，但之后随感染时间延长其转录水平逐渐降低；另外，IPEC-J2 细胞中的IL-6、IL-8 及TNF-α转录水平随着感染时间的延长则显著升高。由此可知，ETEC 感染IPEC-J2 后，可分别激活细胞外受体TLR2/4，同时还激活细胞内NOD1/2 受体，分别通过TLR2/4-NF-κB 及NOD1/2-RIP2-NF-κB 信号通路进一步诱导猪肠道上皮细胞促炎性细胞因子的转录。在分别添加TLR2/4 混合抑制剂AMG-9810 及NOD1/2混合抑制剂NOD-IN-1 分别与IPEC-J2 共作用6 h后，细胞中的TLR2/4 及NOD1/2 mRNA 转录水平均显著下降，再经ETEC 感染后，IPEC-J2 中的TLR2/4、NOD1/2 转录水平同样显著或极显著低于ETEC 组，且下游促炎性细胞因子IL-6、IL-8 及TNF-α mRNA转录水平也受到抑制。由此表明，ETEC 感染IPECJ2 过程中，胞外受体TLR2/4 及胞内受体NOD1/2 被激活，进而诱导下游促炎性因子转录水平的提高。