干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY 基因的鉴定与分析

付家旭，闫亚丽，谢小文，张心悦，温鹏飞，关小康，王同朝，卫 丽

（河南农业大学 农学院，河南 郑州 450002）

玉米（Zea mays）是我国主要的粮食作物，也是重要的饲料和工业原料。近年来，随着全球气候变暖，干旱发生的频率和强度逐年增加，对玉米生产造成严重影响[1]。尤其在播种-出苗阶段，若遭遇干旱，会严重影响玉米出苗和生长。干旱胁迫条件下，水分亏缺会引起气孔关闭，导致光合作用下降，造成减产，严重时甚至绝收[2]。

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质，通过与靶基因启动子区的顺式作用元件结合，激活或抑制基因的表达，在植物逆境胁迫中发挥着重要作用[3]。目前，已发现WRKY、bZIP（Basic leucine zipper）、NAC（NAM、ATAF1/ATAF2 和CUC2）、MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog ）和bHLH（Basic helix-loophelix）等转录因子家族与逆境胁迫密切相关[4-8]。WRKY 是植物中较庞大的一个转录因子家族，自ISHIGURO 等[9]从甘薯中克隆出第一个WRKY 基因SPF1（Sweet potato factor 1）后，在 拟 南 芥（Arabidopsis thaliana）[10]、水稻（Oryza sativaL.）[11]、高粱（Sorghum bicolor）[12]、小 麦（Triticum aestivumL.）[13]、大麦（Hordeum vulgareL.）[14]、玉米[15]和陆地棉（Gossypium hirsutum）[16]等多个物种中鉴定到WRKY基因。WRKY 转录因子通过特异性结合靶基因启动子的顺式作用元件W-box[（T）TGAC（C/T）]而调控基因表达，在植物生长发育及逆境胁迫中具有重要作用[17]。过表达小麦TaWRKY2基因提高了干旱胁迫条件下转基因小麦叶片中的游离脯氨酸、可溶性糖和叶绿素含量，进而提高了对干旱的耐受性[18]。干旱和盐胁迫诱导大豆（Glycine max）GmWRKY12表达，过表达GmWRKY12基因提高了大豆叶片中脯氨酸含量，降低了丙二醛（MDA）含量，最终提高了抗旱性和耐盐性[19]。过表达陆地棉GhWRKY33基因可以提高拟南芥对脱落酸（ABA）和干旱的耐受能力[20]。前期，河南农业大学农学院旱作节水课题组以豫882为试验材料，在苗期进行干旱-复水处理转录组测序分析，从中得到11 002 个差异表达的基因，包括56 个转录因子家族，2 332 个转录因子[5，21-23]。在前期[23]研究基础上，对干旱-复水处理下差异表达的玉米WRKY 基因进行鉴定，并对其蛋白质理化性质、系统进化、染色体分布和复制关系、基因结构和蛋白质保守基序、启动子区顺式作用元件及干旱-复水条件下的表达量等进行分析，为WRKY基因的进一步利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与干旱处理

供试玉米材料为豫882，选取籽粒饱满、均匀的种子，灭菌后播种在土壤∶蛭石为3∶1 的混合土样中，放置于光照培养箱中[温度28 ℃/22 ℃，光照周期14 h/10 h，光照强度120 μmol/（m2·s），相对湿度60%]。待玉米生长至有3 片展开叶时，将其移栽到霍格兰（Hoagland）营养液中，营养液每2 d 更换一次。处理组在营养液中加入20%聚乙二醇（PEG）6000 模拟干旱，分别处理60 h 和96 h，复水3 d，记为T60、T96、TR3d；不进行干旱处理的对照组（霍格兰营养液）分别记为CK60、CK96、CK3d。取叶片立即放入液氮中速冻，然后放置于-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.2 玉米WRKY基因的鉴定

使 用Pfam 数 据 库（http://pfam.xfam.org/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在线网站进一步分析玉米WRKY 基因相对应的蛋白质，去除冗余和重复的基因并删除缺少完整结构域的蛋白质序列，并将其结构域与WRKY 结构域进行比对，保留含有WRKY 结构域的基因。采用RPKM 值计算基因在对照组与处理组之间的表达量差异倍数，以|log2（差异倍数）|≥1、错误率（FDR）＜0.05 为标准，筛选玉米干旱-复水处理中差异表达的WRKY 基因，并 参 考Ensembl Plants（http://plants. ensembl. org/index.html）和MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）数据库进行命名。

1.3 玉米WRKY基因的生物信息学分析

1.3.1 蛋白质分子质量和等电点 利用在线网站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）预测和分析玉米WRKY 基因编码蛋白质的分子质量和等电点。

1.3.2 系统进化 从玉米数据库MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）中下载51 个WRKY 蛋白序列，从TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org/）中下载拟南芥的WRKY蛋白序列，采用DNAMAN软件对玉米和拟南芥WRKY 蛋白的氨基酸序列进行比对，筛选出同源序列。采用MEGA 7.0软件NJ（Neighbor-joining）法构建系统进化树，步长设置为1 000。

1.3.3 基因在染色体上的分布和复制关系 利用Ensembl Plants 下载玉米基因组注释信息，使用TBtools分析基因在染色体上的分布和复制关系。

1.3.4 基因结构和蛋白质保守基序（Motif） 利用GSDS（https://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在线分析WRKY 基因外显子-内含子结构。利用MEME Suite 5.4.1（https://meme-suite.org/meme/）在线预测玉米WRKY蛋白的保守基序，Motif 个数设置为10 个，基序长度为6～70 aa，其他参数均为默认值。

1.3.5 启动子区顺式作用元件 从数据库Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）获取WRKY基 因 上 游2 000 bp 序 列，用Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对WRKY基因启动子区的顺式作用元件进行分析。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析

根据Ensembl Plants 中检索到的候选WRKY 基因的cDNA 序列，使用Primer Premier 5.0 进行qRTPCR 引物设计（表1）。利用Trizol 试剂提取叶片总RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）反转录试剂盒合成cDNA，按照TB GreenPremix ExTaqTMⅡ（TaKaRa）试剂盒说明书进行qRT-PCR，采 用 玉 米18S RNA（GenBank No.AF168884.1）作为内参基因。qRT-PCR 反应体系为20 μL：cDNA 1 μL，TB Green Premix ExTaqTMⅡ10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。qRT-PCR 反应程序：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 个循环。试验进行3 次生物学重复，采用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量[24]。

表1 玉米WRKY基因qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences for WRKY genes in maize

2 结果与分析

2.1 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因的鉴定及理化性质分析

本研究在前期研究结果[23]基础上鉴定出51 个干旱-复水处理下差异表达的玉米WRKY 基因（表2），开放阅读框（ORF）为690～2 248 bp；编码的氨基酸数目最多为729 个，最少为99 个；编码蛋白质分子质量为11.22～78.73 ku。编码蛋白质等电点最小为4.58，最大为12.26，平均为7.6。其中，有20个小于7，占总数的39.22%；有31 个大于7，占总数的60.78%，说明这51 个差异表达的玉米WRKY基因编码的蛋白质偏向于碱性。

表2 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因基本信息Tab.2 The basic information of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

续表2 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因基本信息Tab.2（Continued） The basic information of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

2.2 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因系统进化分析

本研究筛选出31个干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY 基因的拟南芥同源基因，构建玉米、拟南芥WRKY 蛋白系统进化树（图1）。82 个WRKY蛋白可划分为3 组，其中，Ⅰ组含有9 个玉米WRKY蛋白，占玉米总数的17.65%；Ⅱ组有28 个玉米WRKY 蛋白，占玉米总数的54.90%，占比最高，说明Ⅱ组可能在玉米进化中占主体地位；Ⅲ组有14个玉米WRKY蛋白，占玉米总数的27.45%。Ⅱ组又可分为5 个亚组（Ⅱa—Ⅱe），其中，Ⅱc 亚组中含有12 个玉米WRKY蛋白，占玉米总数的27.45%。每个组都有拟南芥WRKY 蛋白，说明玉米和拟南芥的WRKY基因存在平行进化。

图1 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY蛋白与拟南芥同源蛋白系统进化分析Fig.1 Phylogenetic evolution analysis between differentially expressed WRKY proteins in maize under drought-rewatering treatment and part of homologous WRKY proteins in Arabidopsis thaliana

2.3 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因染色体分布与复制关系分析

51个干旱-复水处理下差异表达的玉米WRKY基因不均匀地分布在10 条染色体上（图2）。其中，第3 和第8 染色体上分布的WRKY 基因较多，分别有10、11个；分布最少的是第2和第10染色体，各分布2 个基因。 发生了2 对串联复制事件（ZmWRKY26/ZmWRKY80、ZmWRKY27/ZmWRKY56），分别发生在第8 染色体、第3 染色体上。发生了16对片段复制事件（ZmWRKY102/ZmWRKY109、ZmWRKY73/ZmWRKY82、ZmWRKY106/ZmWRKY86、ZmWRKY87/ZmWRKY52、ZmWRKY43/ZmWRKY57、ZmWRKY27/ZmWRKY80、ZmWRKY74/ZmWRKY86、ZmWRKY48/ZmWRKY124、ZmWRKY25/ZmWRKY38、ZmWRKY29/ZmWRKY111、ZmWRKY43/ZmWRKY115、ZmWRKY56/ZmWRKY26、ZmWRKY103/ZmWRKY111、ZmWRKY82/ZmWRKY68、ZmWRKY57/ZmWRKY115、ZmWRKY74/ZmWRKY106）。其中，7 对片段复制事件（ZmWRKY27/ZmWRKY80、ZmWRKY74/ZmWRKY86、ZmWRKY29/ZmWRKY111、ZmWRKY43/ZmWRKY115、ZmWRKY56/ZmWRKY26、ZmWRKY103/ZmWRKY111、ZmWRKY74/ZmWRKY106））发生在第3 染色体和第8染色体上，表明第3染色体和第8染色体可能与玉米WRKY家族扩张密切相关。

图2 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因染色体分布及复制关系Fig.2 Chromosome distribution and duplication of differentially expressed WRKY genes in maize under droughtrewatering treatment

2.4 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因结构和蛋白质保守基序分析

干旱-复水处理下51 个差异表达玉米WRKY基因结构如图3 所示，玉米WRKY 基因的外显子数是1～12 个，含有3 个外显子的占62.74%。除ZmWRKY25基因外，其余WRKY 基因均含有内含子。大部分同一组或亚组的WRKY 基因具有相对保守的外显子数，如Ⅱc 中除了ZmWRKY30和ZmWRKY108基因外，均含有3 个外显子，Ⅱd 亦是如此。而Ⅰ中外显子数量变化较大，介于2～8个，其中 有 3 个 基 因（ZmWRKY115、ZmWRKY43和ZmWRKY1）含有5 个外显子，2 个基因（ZmWRKY83和ZmWRKY62）含 有3 个 外 显 子，ZmWRKY92、ZmWRKY87、ZmWRKY57、ZmWRKY52分别含有2、4、6、8 个外显子；Ⅲ中ZmWRKY25只含有1 个外显子，ZmWRKY65含有12个外显子。

图3 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因结构和蛋白质保守基序分析Fig.3 Analysis of differentially expressed WRKY gene structure and encoded protein conserved motif in maize under drought-rewatering treatment

41个玉米WRKY 蛋白含有2～4个保守基序，占80.39%。同一组中的WRKY 成员具有相似的基序组成，例如，Ⅰ中都含有Motif1、Motif2、Motif4 和Motif9；Ⅱc 中 除ZmWRKY100（含 有Motif1 与Motif4）外 其 余 成 员 都 含 有Motif1、Motif2 和Motif4。

2.5 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因启动子顺式作用元件分析

为进一步预测玉米WRKY 基因的功能，对51个玉米WRKY 基因上游2 000 bp 启动子区域进行顺式作用元件分析。由图4 可知，51 个玉米WRKY 基因启动子区域含有ABA 响应元件（ABRE）、生长素响应元件（AuxRR-core、TGA-element）、水杨酸响应元件（TCA-element）、赤霉素响应元件（GAREmotif、P-box、TATC-box）、茉 莉 酸 甲 酯 响 应 元 件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、防卫和胁迫响应元件（TC-rich repeats）、低温响应元件（LTR）、干旱响应元件（MBS）、缺氧诱导有关元件（GC-motif）等植物激素及非生物胁迫相关的顺式作用元件。其中，AREB、LTR、MBS、TCA-element 和TGACG-motif 分布较多，而GARE-motif、P-box、TC-rich 和TATCbox 分 布 较 少。 除 了ZmWRKY1、ZmWRKY52、ZmWRKY96和ZmWRKY106外，其余基因均含有ABRE。 含 有 CGTCA-motif 较 多 的 基 因 有ZmWRKY15、ZmWRKY29、ZmWRKY40、ZmWRKY53、ZmWRKY92和ZmWRKY104；ZmWRKY28、ZmWRKY52、ZmWRKY108和ZmWRKY115等24个基因含有MBS；88.24%的ZmWRKY基因含有TGACGmotif，其 中ZmWRKY38、ZmWRKY43、ZmWRKY53、ZmWRKY92、ZmWRKY96和ZmWRKY99含 有4 个 及以上。以上结果说明玉米WRKY 基因在激素信号转导和非生物胁迫响应中可能起着重要的作用。

图4 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因启动子区顺式作用元件分析Fig.4 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

2.6 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因的表达分析

依据转录组结果，在干旱-复水处理下，51个玉米WRKY基因呈现不同的表达模式（图5）。在干旱处理60 h、96 h 和复水3 d 3 个处理时间点，上调表达的基因数分别为25、19、3 个，下调表达的基因数分 别 为26、32、48 个。ZmWRKY1、ZmWRKY10、ZmWRKY16、ZmWRKY28、ZmWRKY30、ZmWRKY33、ZmWRKY42、ZmWRKY65、ZmWRKY68、ZmWRKY78、ZmWRKY96、ZmWRKY99、ZmWRKY100、ZmWRKY102和ZmWRKY111在干旱处理下，其表达量高于对照组，在复水处理后，其表达量低于对照组，说明这15个基因正向响应干旱胁迫。ZmWRKY87基因在干旱处理下下调表达，复水处理后，表达量高于对照组，是负向响应干旱胁迫基因。其他基因的表达模式无规律，如ZmWRKY15、ZmWRKY52、ZmWRKY103等。

图5 干旱-复水处理下差异表达玉米WRKY基因的表达分析Fig.5 Expression analysis of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

为验证转录组数据的可靠性，随机挑选了8 个WRKY 基因（ZmWRKY1、ZmWRKY16、ZmWRKY30、ZmWRKY34、ZmWRKY48、ZmWRKY68、ZmWRKY82、ZmWRKY102）进行qRT-PCR 分析。由图6 可知，ZmWRKY1、ZmWRKY16、ZmWRKY30、ZmWRKY68、ZmWRKY102在干旱处理60 h 和96 h 条件下表达量上升，复水3 d 后表达量下降，正向响应干旱胁迫。其中，ZmWRKY1、ZmWRKY30、ZmWRKY68在3 个处理时间点下均达到显著差异水平。ZmWRKY1、ZmWRKY16、ZmWRKY30、ZmWRKY34、ZmWRKY48、ZmWRKY68、ZmWRKY82、ZmWRKY102这8 个基因在3 个处理时间点的qRT-PCR 结果和转录组结果趋势基本一致，进一步验证了转录组结果的准确性。

图6 干旱-复水处理下部分差异表达玉米WRKY基因的表达验证Fig.6 Expression validation of partial differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

3 结论与讨论

玉米是高需水、需肥作物，而我国玉米主产区大多都存在水资源不足问题，尤其是近年来全球气候变暖，干旱导致玉米产量降低的问题日益突出。玉米生长发育进程中，经常处于干旱-湿润-干旱的动态环境中，尤其是河南省夏季，雨量分配不均。夏玉米播种期或苗期，经常遭遇干旱，而生育中期或后期，降雨量偏多。适宜播期遇旱导致出苗较差，缺苗断垄，苗期干旱导致发育受阻。因此，发掘抗旱基因，培育抗旱品种，提高玉米自身的抗旱能力对玉米生产的发展尤为重要。本研究在转录组结果分析的基础上，鉴定筛选出响应干旱-复水处理的51 个差异表达的WRKY 基因。通过生物信息学分析发现，51 个WRKY 基因不均匀地分布在10条染色体上，部分基因存在片段复制关系，暗示着这些基因在玉米WRKY 基因家族进化中发挥重要作用[25]。进化树分析结果显示，51 个WRKY 基因分成了3 个组，与小麦、拟南芥[26]分类结果一致，进一步说明WRKY 转录因子家族具有平行进化关系。51 个玉米WRKY 基因的启动子区域含有多个与植物激素和逆境胁迫相关的顺式作用元件，如ABRE、TGACG-motif、TGA-element、LTR、MBS 等，进而更加证明WRKY 转录因子在植物逆境胁迫响应中起重要的调控作用。

逆境胁迫下，植物自身通过激活或抑制基因的表达来适应环境条件的变化，进而达到一种平衡。HU 等[27]研究发现，在超表达陆地棉GhWRKY1-like基因的拟南芥植株中，GhWRKY1-like 与ABA 生物合 成 所 必 需 的AtNCED2、AtNCED5、AtNCED6和AtNCED9基因启动子的W-box 顺式作用元件结合，促进这些靶基因的表达，从而提高植株的抗旱性。XIONG 等[3]研究发现，超表达文冠果XsWRKY20基因通过ABA 途径提高烟草的抗旱性。本研究发现，在干旱-复水处理下，51 个玉米WRKY 基因呈现出不 同 的 表 达 模 式。ZmWRKY1、ZmWRKY10、ZmWRKY16、ZmWRKY28、ZmWRKY30、ZmWRKY33、ZmWRKY42、ZmWRKY65、ZmWRKY68、ZmWRKY78、ZmWRKY96、ZmWRKY99、ZmWRKY100、ZmWRKY102和ZmWRKY111这15 个正向响应干旱胁迫基因与1个负向响应干旱胁迫基因（ZmWRKY87）是今后深入研究ZmWRKY家族干旱胁迫响应的候选基因，可为玉米抗旱分子育种以及培育玉米新品种奠定基础。