不规则抗体阳性患者外周血Tfh、Tfr细胞亚群检测及临床意义

黄国清 张勇刚 伍昌林 王强 王素云 周仁龙 杨东莞 彭银艳

输血依赖性地中海贫血患者需长期依赖输血维持生命，定期输血患者易产生血型不规则抗体。近年定期输血患者同种免疫机制与防治策略是全球研究的热点与难点，目前国内外研究表明Th1、Th2、Th17 及Treg 细胞失衡与同种免疫相关，但近年研究的新型Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 细胞亚群免疫平衡在血型同种免疫中的作用尚不完全明确[1～3]。本项目将研究血型同种免疫产生的不规则抗体阳性患者外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 细胞亚群比例及ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 水平，分析Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值变化及其临床意义，探讨Tfh、Tfr 细胞亚群及相关因子在血型同种异体免疫机制中的作用，为定期输血患者血型不规则抗体的预防提供实验依据与治疗思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2019年1月～2021年7月在我院定期输血的不规则抗体筛查阳性患者32 例，其中男15 例，女17 例，年龄14～58 岁，平均32.5 岁。排除合并自身抗体或其它自身免疫病的患者。随机选择定期输血的32 例不规则抗体筛查阴性患者作为对照组，其中男18 例，女14 例，年龄13～56 岁，平均34 岁。本研究符合我院伦理标准，获伦理委员会的批准，参与者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 不规则抗体筛选细胞（上海生物医药），不规则抗体鉴定谱细胞（荷兰三昆公司），细胞检测的荧光标记抗体：抗人-CXCR5单克隆抗体，抗人-CD4 单克隆抗体、抗人-FoxP3 单克隆抗体、抗人-CXCR3 和CCR6 单克隆抗体；同型对照的荧光抗体IgG1 单克隆抗体（美国BD 公司）。酶标仪（汇松MB-580）和流式细胞仪（美国BD 公司），细胞因子ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 ELISA 试剂盒（美国RD 公司），KA-2200 型离心机（日本久保田），卡式离心机（西班牙戴安娜公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 两组外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 细胞亚群的检测 抽取EDTA 抗凝的不规则抗体阳性患者外周血3ml，利用Ficoll 淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），分离细胞浓度为1×106的PBMC 悬液100μl；分别加入荧光标记抗体：一组加入CD4、CXCR5、FoxP3 抗体；另一组加入CD4、CXCR5、CXCR3 和CCR6 抗体，4℃避光孵育30min，1 800r/min 离 心6min 弃上清，加入PBS 2ml 吹打均匀，再次1 800r/min 离心6min 弃上清；然后上流式细胞仪检测上述细胞。外周血Tfh 及其亚型定义如下：Tfh：CD4+CXCR5+T 细胞；Tfh1：CXCR3+CCR6-Tfh 细胞；Tfh2：CXCR3-CCR6-Tfh 细胞；Tfh17：CXCR3-CCR6+Tfh 细 胞；Tfr：CD4+CX CR5+FoxP3+T 细胞。分析比较Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr细胞亚群的比值变化。

1.3.2 两组外周血ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 细胞因子检测 取前期冻存血清，溶解后每个样本和标准品均设3 孔检测，酶标仪在520nm 波长处读取OD 值并取均值，由标准品在配套软件上自动绘制标准曲线，将各样本的OD 值在标准曲线上找到对应值，获得待测样本ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10含量，并比较ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值差异。以上操作均按ELISA 试剂盒说明书进行。

1.3.3不规则抗体阳性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值与血型不规则抗体效价变化的相关分析 采用倍比稀释法检测血型不规则抗体的效价水平（IgG、IgM 或IgG+IgM），同时比较分析不规则抗体阳性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值变化，Spearman 相关分析法评价其与不规则抗体总效价变化的相关性。

1.4 统计学分析 本研究所有实验结果均采用SPSS 25.0 软件进行统计分析。两组间差异采用两样本t检验，两变量间的相关性用Spearman 相关分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 细胞亚群与Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 比值比较 与对照组比较，实验组CD4+T 细胞中CXCR3-CCR6-Tfh（Tfh2）细胞的比例升高，而CD4+CXCR5+FoxP3+T 细胞（Tfr）比例降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。Tfh1/Tfh2 细胞亚群比值降低，Tfh17/Tfr 细胞亚群比值升高，两组CXCR3+CCR6-Tfh 细 胞（Tfh1）与CXCR3-CCR6+Tfh细胞（Tfh17）比例无显著性差异（P＞0.05），见表1。

2.2 两组外周血Tfh/Tfr 细胞亚群的效应细胞因子ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 及ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比较 与对照组比较，实验组血清中IL-4水平明显高于对照组，IL-10 的表达水平低于对照组，IL-17/IL-10 比值高于对照组，ILN-γ/IL-4 比值低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组细胞因子ILN-γ、IL-17 水平比较无显著性差异（P＞0.05），见表2。

表1 两组外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 细胞与Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 比值（±s）

表1 两组外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 细胞与Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 比值（±s）

组别 例数 Tfh1（%） Tfh2（%） Tfh17（%） Tfr（%） Tfh1/Tfh2 Tfh17/Tfr实验组 32 22.63±5.61 3.80±0.69 22.46±3.27 2.56±2.32 5.35±1.21 8.35±2.23对照组 32 24.41±4.35 1.53±0.38 20.98±4.25 4.20±1.34 15.64±3.35 4.94±1.38 t 1.42 16.3 1.24 3.49 16.6 7.53 P＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 外周血ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 及ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比较（±s）

表2 外周血ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 及ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比较（±s）

组别 例数 ILN-γ（pg/ml） IL-4（pg/ml） IL-17（pg/ml） IL-10（pg/ml） ILN-γ/IL-4 IL-17/IL-10实验组 32 80.56±15.22 26.35±6.83 71.31±12.81 21.35±5.58 3.05±1.72 3.55±0.72对照组 32 77.31±10.23 15.37±5.65 75.37±13.64 45.55±8.66 5.13±1.85 1.66±0.82 t 1.01 7.26 1.28 13.3 4.75 9.52 P＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 不规则抗体阳性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值与不规则抗体效价的相关性分析 不规则抗体效价范围为1：2 至1：256，经Spearman 相关性分析表明Tfh17/Tfr、IL-17/IL-10比值变化与不规则抗体效价呈正相关（r=0.59、0.75，P均＜0.05），见图1A、1B；外周血Tfh1/Tfh2、ILN-γ/IL-4比值变化与不规则抗体效价呈负相关（r=-0.48、-0.77，P均＜0.05），见图1C、1D。

图1 Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值与不规则抗体效价的相关性

3 讨论

输血依赖性地中海贫血患者需长期依赖输注异体红细胞悬液，因此易产生红细胞血型抗原同种免疫。但是血型同种免疫的发生机制目前尚不明确，如何有效预防同种异体血型不规则抗体的产生，减少输血反应，提高临床输血疗效，是临床输血研究的热点。目前国内外科研人员对输血同种免疫患者的细胞免疫平衡进行了大量研究，发现Th1、Th2、Th17 与Treg 等免疫细胞平衡在血型同种免疫机制中发挥重要作用[4，5]，但是Tfh 细胞亚群（Tfh1、Tfh2、Tfh17）与Tfr 细胞在血型同种免疫机制中的作用尚不完全清楚且报道较少。

CD4+CXCR5+Tfh 细胞是CD4+效应性T 细胞，其可辅助B 细胞产生抗体并通过IL-10、IL-21 等效应因子发挥作用。Tfh 细胞亚群与Tfr 细胞的免疫失调在自身免疫性疾病发生机制中的作用近年已被证实[6]，但其在血型同种免疫中的研究报道较少。外周血Tfh 细胞可根据表面趋化因子CXCR3 和CCR6不同分为3 种不同功能亚群：Tfh1、Tfh2、Tfh17；此外Tfr 兼有Tfh 及Treg 细胞双重性质。这些细胞亚群与自身免疫病患者自身抗体的产生密切相关[7]。Tfh1、Tfh2、Tfh17 及Tfr 与传统的Th1、Th2、Th17及Treg 细胞亚群相似，可分泌ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 等不同的效应细胞因子，但Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 细胞平衡在血型同种免疫中的作用机制尚不十分明确。本研究发现输血过程中部分患者易发生血型同种免疫，可能由于Tfh 细胞亚群辅助B 细胞产生高亲和力同种抗体，Tfr 细胞则可抑制血型同种抗体产生，但影响血型同种抗体产生的Tfh亚群类型不明确。有研究发现Th17/Th22/Treg 平衡失调参与自身免疫病患者自身抗体产生[8]，但尚不完全明确血型不规则抗体阳性患者外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17 与Tfr 平衡偏移及其血型同种抗体效价之间的关系。

本研究对血型不规则抗体阳性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 细胞平衡状况进行探索，发现与对照组相比，实验组患者CD4+T 细胞中Tfh2 细胞比例升高，而Tfr 比例降低，Tfh1 与Tfh17 比例无显著性差异，而Tfh1/Tfh2 细胞亚群比值降低，Tfh17/Tfr 细胞亚群比值升高，差异有统计学意义（P＜0.05），Tfh17/Tfr 与患者血型不规则抗体的效价呈正相关，Tfh1/Tfh2 比值与患者血型不规则抗体效价呈负相关。结果提示Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 细胞失调可能参与血型同种免疫机制，免疫抑制细胞数量或功能下降可能是血型同种免疫易感性的重要原因之一[9，10]。同时Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 细胞效应分子水平也可能与血型不规则抗体的发生率相关，实验组患者外周血血清中IL-4 水平明显高于对照组，IL-10 的表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；细胞因子ILN-γ、IL-17 与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。实验组IL-17/IL-10 比值高于对照组，ILN-γ/IL-4 比值低于对照组，且IL-17/IL-10 比值与血型不规则抗体效价呈正相关，ILN-γ/IL-4 比值变化与血型不规则抗体效价呈负相关。表明血型同种免疫患者Tfh1/Tfh2 细胞变化与Tfh17/Tfr 的调节效应相反，这与当前研究结果相近[11～13]，Tfh2 亚群可能促进血型同种免疫产生，激活机体免疫效应功能[14]。

本研究分析表明Tfh2 细胞亚群是血型不规则抗体产生的重要效应细胞，而Tfr 细胞具有负性调节功能，可抵制或减弱血型同种异体免疫的产生；由于血型抗原同种免疫患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比例失调，可能是导致定期异体输血患者血型抗原同种免疫发生的重要原因，但具体信号调控机制有待深入研究[15]，因此我们可将Tfh2、Tfr 细胞亚群平衡及其效应因子IL-4、IL-10 作为预防血型抗原同种免疫的新靶标，可通过免疫调节纠正定期输血患者Tfh/Tfr 细胞亚群比例失衡，对预防并减少血型不规则抗体的发生具有重要意义。