茶叶活性成分对梨火疫病菌的抑制活性及稳定性研究

荣 华，刘 龙，郭庆元

（新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052）

0 引言

中国是全球种植梨树的三大起源中心之一，也是全球主要的梨生产区域，梨种植面积和产量占世界梨栽培面积和总产量的69.1%和68.4%[1]。梨火疫病(Erwinia amylovora)[2]是中国重大检疫性细菌病害，该病传播速度快、寄主多，目前已经分布扩散在世界近60多个国家及地区。近几年内，与中国相毗邻的国家如：韩国、哈萨克斯坦、日本等相继有该病害的报道。

中国是世界茶叶的发源地，是产茶大国，也是茶叶的出口大国。茶是中国的国饮，是现在世界上消费量最大的饮品之一[3]。1949年开始，中国茶叶产业发展迅速，1950年中国茶叶产量达6.5万t，随着技术的发展，在2018年茶叶产量高达272.6万t[4]。茶叶和茶籽中含有许多活性成分，具有杀菌抑菌[5]的作用,茶活性成分可以对人的致病菌起到抑制作用，也对许多植物病原菌有抑制作用[6-7]。茶多酚具有抗氧化[8]、抗衰老、降血糖[9-10]、调节免疫、抑制肿瘤细胞生长等广谱作用[11]；壳寡糖是壳聚糖经物理化学或特殊的生物酶降解得到的一种寡糖产品，其易溶于水，功能多[12]，壳寡糖的作用广泛，可以抑菌、抗氧化、诱导植物抗病性等，动物上可以抗病毒、降血脂等现在已经被广泛运用和报道[13-17]。茶皂素是油茶加工过程中的一种副产物，现已被广泛利用，是一种天然农药，可作为原料或助剂生产高效低毒的农药[18-19]。现已有很多研究表明，茶活性物质对细菌和真菌都具有一定的抑菌作用。但专门针对植物细菌性病害的研究报道尚少。本研究首先选取茶皂素、绿茶提取物茶多酚和壳寡糖对梨火疫病菌进行了抑菌活性测定实验；为了解绿茶提取物茶多酚对梨火疫病菌抑菌活性的稳定性，进一步测定其在不同温度、pH和不同时间紫外照射后的抑菌活性，探讨其在农业病害防治中推广使用的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

梨火疫病菌(Erwinia amylovora)。由新疆农业大学农学院植物病理系作物病害研究室A409室提供。

壳寡糖：购自山东陆海蓝圣生物科技股份有限公司，含量98%。绿茶提取物茶多酚：购自安徽红星药业股份有限公司，含量98%。茶皂素：购自天利生物科技，含量95%。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 在无菌工作台中，将接种环在火焰上灼烧几次，挑取少许菌苔于装有液体NA培养基的锥形瓶中，放入摇床混匀，制成菌悬浮液。细菌用比浊法计数，调整菌悬液的浓度，制成含菌体量为1×106CFU/mL的菌悬液，备用。

1.2.2 茶活性物质抑菌力测定 称取一定量的茶皂素、绿茶提取物茶多酚和壳寡糖粉剂，分别加入无菌水溶解成浓度为400 mg/mL的茶皂素溶液、茶多酚溶液和壳寡糖溶液。然后用无菌水将400 mg/mL的溶液稀释成如下几个浓度备用：200、250、300、350 mg/mL。

用打孔法，在无菌条件下，将100 μL菌悬液加入到固体NA培养基，用无菌三角玻璃棒涂布均匀后分为3个区域，分别在每个区域中心用8 mm的打孔器打孔，向孔中加入100 μL的茶活性物质溶液，移至28℃恒温培养箱恒温培养24 h，观察病菌生长情况以及抑菌圈直径，用游标卡尺测量抑菌圈直径，记录数据(mm)，实验重复3次。以3次实验数据的平均值为依据进行统计分析。

1.2.3 绿茶提取物茶多酚对梨火疫病菌最低抑菌浓度(MIC)的测定 称取绿茶提取物茶多酚配成以下几个浓度备用：8、10、15、20、25、30、35、36、37、38、39、40、50、75、100 mg/mL，以无菌水为对照。

用打孔法，在无菌条件下，将100 μL菌悬液加入到固体NA培养基，用无菌三角玻璃棒涂布均匀后分为4个区域，分别在每个区域中心用8 mm的打孔器打孔，向孔中加入100 μL不同浓度的绿茶提取物茶多酚溶液，移至28℃恒温培养箱恒温培养24 h，观察病菌生长情况以及抑菌圈的大小，设定以有抑菌圈的最小浓度为最低抑菌浓度[20](MIC)，实验重复3次。以3次实验数据的平均值为依据进行统计分析。

1.2.4 绿茶提取物茶多酚抑菌稳定性的测定

（1）温度对绿茶提取物茶多酚抑菌活性影响 采用106CFU/mL梨火疫病菌为指示菌、40 mg/mL绿茶提取物茶多酚溶液进行实验。将绿茶提取物茶多酚分别在10、40、60、80、100℃下处理30 min，以未处理的提取物作为对照，采用1.2.2方法测定抑菌活性。

（2）pH对绿茶提取物茶多酚抑菌活性影响 采用106CFU/mL梨火疫病菌为指示菌、40 mg/mL绿茶提取物茶多酚溶液进行实验。分别用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH将绿茶提取物茶多酚的pH调整为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，以未调节pH的提取物为对照(pH=4.72)，采用1.2.2方法测定抑菌活性。

（3）紫外线照射对绿茶提取物茶多酚抑菌活性影响 采用106CFU/mL梨火疫病菌为指示菌、40 mg/mL绿茶提取物茶多酚溶液进行实验。将绿茶提取物茶多酚原液置于紫外灯光下（20 W，紫外灯距样品15 cm）分别照射10、20、30、40、50 min，以未进行照射的提取物为对照，采用1.2.2方法测定抑菌活性。

1.3 数据处理

每个处理重复3次，试验结果用SPSS 26.0软件进行数据处理并分析，统计学方法采用单因素方差分析，P＜0.05表明具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 茶活性物质对梨火疫病菌的抑菌活性测定

采用打孔法检测茶活性物质的抑菌活性，根据药理学实验方法[21]进行判断：抑菌圈直径≤6 mm为无抑菌活性，＞6 mm判断为有抑菌活性，10 mm≥抑菌圈直径＞6 mm视为低度敏感，15 mm≥抑菌圈直径＞10 mm视为高度敏感。实验结果表示100 μL不同浓度的3种茶活性物质对供试细菌的抑菌活性不同，绿茶提取物茶多酚抑菌效果明显，对梨火疫病菌有强抑菌活性且为高度敏感；壳寡糖有抑菌圈但抑制效果不明显，浓度＞350 mg/mL时有抑菌活性为低度敏感，浓度≤300 mg/mL时无抑菌活性；茶皂素对梨火疫病菌没有抑菌活性，如图1、图2所示。

图1 100 μL的茶活性物质对梨火疫病菌生长的抑制作用

图2 100 μL茶活性物质对梨火疫病菌的抑菌效果

进一步研究绿茶提取物茶多酚与壳寡糖之间同浓度不同体积下抑菌情况，可知，当加入50 μL浓度为400 mg/mL的绿茶提取物茶多酚和壳寡糖，抑菌效果比加入100 μL同浓度溶液时较差；50 μL绿茶提取物茶多酚浓度≥350 mg/mL时为高度敏感；50 μL壳寡糖浓度≥400 mg/mL时有抑菌活性为低度敏感，如图3、图4所示。

图3 50 μL的茶活性物质对梨火疫病菌生长的抑制作用

图4 50 μL茶活性物质对梨火疫病菌的抑菌效果

2.2 绿茶提取物茶多酚最小抑菌浓度(MIC)

绿茶提取物茶多酚MIC结果如表1所示。绿茶提取物茶多酚MIC为40 mg/mL。

表1 绿茶提取物茶多酚的最小抑菌浓度

2.3 绿茶提取物茶多酚抑菌活性的稳定性探究

2.3.1 温度对绿茶提取物茶多酚抑菌活性影响 绿茶提取物茶多酚经不同温度处理后，与对照相比其抑菌活性虽略有下降，但即使用100℃高温处理30 min后依然也保持抑菌活性（图5），说明绿茶提取物茶多酚有较好的热稳定性，在100℃下的温度不易发生分解，因此常规操作温度下不会对其抑菌活性造成影响。

图5 温度对绿茶提取物茶多酚稳定性的影响

2.3.2 pH对绿茶提取物茶多酚抑菌活性影响 绿茶提取物茶多酚对供试菌在较宽的pH范围内都有抑菌活性，但随pH的变化有所波动（图6），具体表现为随着处理pH的升高(2～10)其抑菌活性逐渐降低，当pH为2时抑菌活性达到最大，其抑菌活性较对照组升高40%。在弱酸性条件(pH=4、6)下，其抑菌活性较对照组分别降低21.95%和44.73%；碱性条件下(pH=8、10)其抑菌活性较对照组下降了60.76%和100%。可能是提取物经碱处理后使所含的某些抑菌成分与碱发生反应，从而导致该抑菌成份的抑菌活性消失。

图6 pH对绿茶提取物茶多酚稳定性的影响

2.3.3 紫外线照射对绿茶提取物茶多酚抑菌活性影响不同紫外照射时间对绿茶提取物茶多酚的影响（图7），与对照相比，当处理时间为10、20 min时，其抑菌活性比较稳定，但随着处理时间的延长(30、40、50 min)其抑菌活性略有下降。

图7 紫外线照射时长对绿茶提取物茶多酚稳定性的影响

3 讨论与结论

茶多酚抑菌作用广泛，茶多酚的抑菌特点[22]抑菌谱广泛、抑菌活性强并且不易使细菌产生耐药性。对革兰氏阴性菌、兼性厌氧菌、产芽孢杆菌等都具有明显的抑制作用。唐裕芳[23]研究表明茶多酚相对细菌由较强烈的抑菌作用，盐能提高茶多酚的抑菌活性。壳寡糖和茶皂素在前人研究中均有一定的抑菌效果。本研究中茶多酚抑制效果较好，壳寡糖具有一定的抑菌效果与前人研究结果基本一致，但本研究中茶皂素对梨火疫病菌没有抑菌效果与前人研究的结果不同，有待进一步研究茶多酚的抑菌机理。丁香提取物和诃子的水提物在高温处理下，也不会影响其抑菌效果[24-25]，本研究中绿茶提取物茶多酚热稳定性好，与前人研究结果基本一致，绿茶提取物茶多酚的热稳定性是其后续资源开发利用的前提和保障。本试验结果表明外界pH影响绿茶提取物茶多酚的稳定性，在酸性环境下，其抑菌活性较为稳定，偏碱性会导致其抑菌效果减弱，此结果与酚类物质的酸碱稳定性结果相一致[26]，在碱性环境下，其潜在的抑菌活性物质酚酸类化合物的酚轻基被破坏，水解生成醒类物质，导致其抑菌活性降低[27]。前人研究表明，一些功能性植物提取物如原花青素[28]、黄酮[29]、多酚[30]等物质在长时间紫外辐射的环境中其含量持续降低，说明目标物质发生了分解；本试验中绿茶提取物茶多酚的抑菌效果随着紫外照射时间的增加在减弱，与前人研究基本一致；紫外照射30 min以上，抑菌活性明显下降，因此，在紫外光灭菌处理时，尽量不超过20 min。据报道，茶叶中的有效成分除了对植物病原菌等具有较好的抑制作用外，对肠道中的有益菌群也具有很好的保护作用。但目前，对于茶叶活性物质对抑制植物细菌性病害的研究甚少，本文只针对绿茶三种提取物对细菌的抑菌效果的初步研究，还需继续探讨其抑菌机理，进一步开发其在防治上的应用，还需进一步研究不同品种茶叶对细菌的抑制作用，探讨不同茶叶所含抑菌因子浓度对细菌的抑菌作用，为茶叶作为一种“天然农药”奠定基础。

本实验结果表明，不同茶活性物质对梨火疫病菌的敏感性亦有较大差别。绿茶提取物茶多酚和壳寡糖对梨火疫病菌有一定的抑菌效果，且抑菌效果与其浓度成正比关系，也与加入的液体体积大小有关，绿茶提取物茶多酚抑菌效果较好，表现为高度敏感，茶皂素对其没有抑菌效果；绿茶提取物茶多酚对梨火疫病菌的MIC为40 mg/mL；抑菌稳定性实验表明，绿茶提取物茶多酚具有良好的抑菌稳定性，10～60℃时抑菌活性保持稳定，但经高温度80～100℃处理后，抑菌活性略有下降；在pH=2时抑菌活性增强，碱性条件下抑菌活性减弱；紫外照射在30 min以上，抑菌活性会略微下降。本文研究结果为茶叶活性物质抑菌机理的探究提供了数据支撑，为茶活性物质对梨火疫病防治提供了理论依据。