先进的组学技术在植物抗病研究中的应用

陈明月，姜 涛，赵冬梅，白 莉，张雪琦，孟 姣

（1黑龙江东方学院食品工程学院，哈尔滨 150086；2黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨 150080）

0 引言

组学技术是分子生物学领域中先进技术之一。组学技术主要包括基因组学，转录组学，蛋白质组学和代谢组学四个反面[1]。随着生物学研究的不断深入，单一基因、蛋白功能研究不能完全阐释生命体错综复杂的关系，组学技术从整体角度出发，探究生物体细胞结构，基因及蛋白质等分子之间的相互作用[2]。目前组学技术成为了解决生物学难题的有效手段，例如影像组学技术、多组学联用技术应用于肿瘤及其他疾病的精准治疗，质谱技术、核磁共振技术应用于食品掺假及食源性致病菌检测，以双向电泳技术与质谱技术为主的蛋白质组学技术应用于环境毒理学[3-7]。同时，组学技术在药用植物的鉴定，植物的逆境胁迫和植物优势物种的选育等领域研究也颇多。植物病害严重威胁着植物的生长和发育，同时也影响着中国农业的生产和储存，其发生的原因具体分为侵染性病害（细菌、真菌、病毒和昆虫侵蚀）和非侵染性病害（光照、水分、温度和农药）[8]。

由于农业生产方式、种植制度改变以及环境污染加剧，一些传统的病害如稻瘟病、赤霉病和根腐病等植物疾病愈发严重。如今生物防治例如生防细菌、生防真菌及生防放线菌的开发利用越来越受到重视，抗病育种等科学方法日益改善，但是人们往往对植物抵御病害机制认识不深入，导致抗病研究受阻。因此明确参与植物抗病的信号传导途径，确定关键调控因子和不同调控因子形成的调控网络关系，从而系统地揭示植物抗病性与其生长发育之间的协调关系极为重要[9]。在探究植物抗病过程中，组学技术是探究植物抗病机理，和抗病前后植物的生长和代谢等生理变化很好的技术手段。本文主要综述了组学技术在植物抗病研究中的应用，对提高植物的抗病性，探究植物抗病机理及优势物种的选育进行了具体阐述。

1 组学技术在植物抗病研究中的应用

1.1 基因组学技术

基因组学利用生物信息学技术对物种的所有基因及基因产物进行定量研究、功能分析以及表达调控，揭示生物体生命活动变化规律[10-11]。其研究内容从结构、功能基因组学逐渐扩大到宏基因组学和表观基因组学等[12-13]。基因组学的研究使我们在了解植物基因组的结构、功能和进化方面取得了巨大的进展。下一代测序技术（NGS）的兴起和不断改进，从基因组测序方法到标记辅助育种，使得基因组学广泛应用在作物改良中[14]。通过插入突变和沉默基因策略以及表达模式分析发现的基因功能，使得功能基因组学在转基因作物中提供独特的应用[15]。植物病原体基因组学可以识别植物疾病产生的原因，帮助找到病原菌防治方法，减少植物耐药性的发生，防止农药污染，同时促进植物清理重金属或其他化合物污染的土壤[16]。

1.1.1 基因组学技术在生物胁迫中的应用 XU等[17]利用基因组学技术在中国主要品种‘扬麦16号’和‘中麦895’的双单倍体(DH)群体中鉴定抗白粉病的数量性状位点(QTL)。在此研究中发现的新的QTL及其紧密连锁标记将有助于提高白粉病抗性品种的选育。YU等[18]在比较基因组学基础上设计了一种常见正向引物和物种特异性反向引物，建立了一种快速、可靠的多重PCR方法。并且同时检测出黄瓜中5种重要病原菌，为黄瓜田间病害诊断提供了一种有效工具。谷子叶瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的，是中国最常见的稻瘟病。TIAN等[19]在‘豫谷5号’的1号、2号和8号染色体上，利用基因组重测序分析鉴定出3个抗稻瘟病的QTL，分别是QLB-czas1、QLB-czas2和QLB-cazas8，这些新抗性QTL的鉴定将应用于新品种选育、谷子抗稻瘟病遗传控制研究。

1.1.2 基因组学技术在生防菌中的应用 芽孢杆菌B25是一种有效的玉米病原真菌镰刀菌(Fusarium verticillioides，Fv)生防剂，DOURIET-GÁMEZ 等[20]为了确定生物防治所涉及的遗传性状，对B25基因组进行了测序和分析，同时对芽孢杆菌属(Bacillus)中的5种菌株与植物病原真菌生防菌进行比较基因组分析，为进一步研究B25与Fv相互作用过程中基因表达奠定了基础。噬菌体可对植物病原菌进行防治，并且可以降低致病菌的发病率[21]。侯玉刚[22]从发病的番茄种植土壤中筛选出4种青枯菌(Ralstonia solanacearum)专性噬菌体，通过对这4种噬菌体的全基因组分析和生物学特性研究，确定这4种噬菌体均可有效抑制番茄青枯病，并为研制一种新型的抗青枯病药物提供了理论依据。

1.2 转录组学技术

转录组学是一种基于DNA微阵列技术(DNA microarray)和测序技术对信使RNA(mRNA)全基因组表达水平测量的研究[23]，在整体水平上揭示基因转录情况及转录调控规律。主要技术包括基因表达系列分析技术(SAGE)、大规模平行测序技术(MPSS)和RNA测序技术(RNA-seq)[24]。一种新的表达序列标签技术-微卫星标记(EST-SSR）被广泛应用于植物的品种鉴定、遗传图谱构建与基因定位克隆等方面[25]。高通量技术的不断发展，使得RNA-seq在植物病原菌及植物与真菌互作研究中有广泛应用[26]，同时，基于多孔板法和液滴法的单细胞转录组测序技术(scRNA-seq)可获得植物稀有细胞的基因表达情况，通过进行分离和培养从而用于高通量分析，有助于鉴定植物细胞类型和探索细胞生物学过程[27]。

1.2.1 转录组学技术在生物胁迫中的应用 花生早期叶斑病(ELS)是由花生尾孢菌(Cercospora arachidicola)引起的一种严重的花生叶片病害，严重影响了花生的产量。GONG等[28]利用RNA-seq技术鉴定了与ELS抗病性相关的133个差异表达基因，其中免疫调节因子PAD4在花生早期叶斑病抗性中发挥重要作用，为植物抗花生叶斑病机理研究提供科学依据。木薯花叶病(CMD)是热带主要农作物木薯的一种病毒性病害，FREGENE[29]等采用SAGE技术从木薯子代中提取的大量CMD抗性和易感基因型的mRNA，作为鉴定CMD抗性基因工程的一个步骤。HU等[30]通过基因芯片技术鉴定低酸碱度胁迫下小麦幼苗的差异表达基因，结果表明WRKY转录因子可能在转录调控中发挥重要作用，根际碱化可能是小麦幼苗根系对低pH胁迫最早的响应过程，为揭示植物质子耐毒的分子机制提供了依据。甘蓝黑腐病严重影响甘蓝的产量和品质，SONG等[31]通过对黑腐病处理后抗性和敏感甘蓝品系之间的综合转录组谱分析，表明了NBS-LRR genes,protein kinase genes and expansin genes等在调节对黑腐病感染的早期反应中起关键作用，为甘蓝抗黑腐病的遗传和功能研究提供新的见解。

1.2.2 转录组学技术在生防菌中的应用 西瓜枯萎病是一种影响西瓜产量的土传病害，米丹丹[32]通过平板拮抗和温室促生防病实验等方法筛选出生防菌F11，利用RNA-seq技术揭示F11是通过激活西瓜枯萎病的抗性基因，来提高西瓜对枯萎病的抗性。ZHANG等[33]为了更好地探究丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)的抗病性，对接种AMF的根腐病高发时期大豆进行转录组学和蛋白质组学分析，结果显示接种AMF后大豆根系中苯丙氨酸解氨酶、钙依赖性蛋白激酶和其他防御相关蛋白表达上调，表明接种AMF促进了大豆的发育增加了植株抗病性。

1.3 蛋白质组学技术

蛋白质组学是在基因组学水平上，对蛋白质组的表达、修饰及相互作用的研究，其主要研究内容为功能蛋白质组和结构蛋白质组[34]。由于蛋白质分析是确定其相关基因功能的最直接方法，因此与基因组序列信息相关的蛋白质组分析是功能基因组学中一个非常强大的工具[35]。蛋白质组学技术主要包括分离技术、蛋白质组质谱分析技术和生物信息学技术，如蛋白质双向电泳技术(2-DE)、同位素标记相对和绝对定量标记技术(iTRAQ)、非定量标记技术(Lable-free)和新兴技术多种全新数据非依赖性采集(DIA)等[36]。蛋白质组学在植物与病原菌的相互作用中有所应用，如致病性决定因子（效应蛋白）、抗病蛋白（抗性和致病相关蛋白）及其通过翻译后修饰的调控作用[37]。同时，基于质谱的蛋白质组学提供了更精确地研究植物的技术手段[38]。

1.3.1 蛋白质组学技术在生物胁迫中的应用 大豆连作容易引发根腐病，摩西管柄囊霉(Funneliformis mosseae)可有效抑制大豆根腐发生。BAI等[39]采用iTRAQ和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对接种了F.mosseae的连作大豆进行蛋白质差异表达的分析，为进一步研究F.mosseae解决大豆连作障碍提供了理论基础。钟俐等[40]利用2-DE技术对甜瓜白粉病的染病品种和抗病品种的差异蛋白进行鉴定分析，对抗病机理进行了深入的研究。玉米赤霉菌(Gibberella zeae)是一种自育子囊菌，能引起玉米等谷类作物的重要疾病，疾病控制需要全面了解玉米有性生殖。LEE等[41]为了鉴定参与这一过程的真菌蛋白质，比较了玉米有性生殖的主要调控因子MAT1-2的野生型菌株和其自身不育菌株的蛋白表达。采用2-DE和质谱联用技术分析了13个蛋白位点蛋白表达差异。这是迄今为止第一个应用蛋白质组学方法在玉米中成功地鉴定由MAT1-2调控的蛋白差异表达案例。

1.3.2 蛋白质组学技术在非生物胁迫中的应用 干旱是严重制约植物生长的环境因素，为了研究大麦对干旱胁迫的初步反应，KAUSAR[42]利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(2D-PAGE)分析了大麦蛋白质谱的变化，结果表明叶绿体代谢和能量相关蛋白在干旱胁迫下大麦幼苗的适应过程中可能起着重要的作用。盐胁迫是一种非生物胁迫，土壤中盐离子浓度的提高导致植物对营养元素和水分吸收降低[43]。陈晓晶等[44]探究了盐胁迫对燕麦的生理指标影响，通过对燕麦进行盐胁迫处理，同时利用Lable-free技术分析差异蛋白的表达，确定响应盐胁迫的相关蛋白，为探究农作物抗盐机制奠定了基础。

1.4 代谢组学技术

代谢组学是一门研究完整生命系统的代谢物补体及其对内源性因素（如生理和发育）和外源性因素（如环境因素和外源性物质）变化动态反应的新兴学科，代谢物的变化承载着代谢水平、基因表达和蛋白质功能方面的丰富信息[45]。代谢组学广泛应用于植物功能基因组的研究，利用色谱-质谱联用、核磁共振技术(NMR)对生物样品中的小分子代谢物进行定性与定量，可更快寻找植物功能基因，同时了解植物与环境之间互作过程，推进农作物品质改良[46-47]。代谢组学在植物领域大多应用在代谢轮廓或代谢物指纹图谱方面，根据不同基因型的植物进行鉴别和分类，其次可根据对代谢物的定性与定量分析，来判断植物的不同生长阶段[48]。近年来，代谢组学联合全基因组关联分析技术(mGWAS)已经不断应用于植物代谢物遗传多样性等多方面的研究中，为深入了解不同条件下代谢途径，提高农作物产量与质量提供服务[49]。

1.4.1 代谢组学技术在生物胁迫中的应用 香蕉炭疽病是香蕉采后最严重的病害之一，LI等[50]对香蕉皮应用比较转录组和代谢组学分析方法，对褪黑素处理后的香蕉差异调控基因和代谢产物进行了研究和鉴定，为进一步了解褪黑素治疗香蕉果实衰老和炭疽病的发生提供了理论基础。KASOTE等[51]为探究西瓜在抗枯萎病过程中引起防御反应的关键代谢物，分析了西瓜枯萎病抗性和易感西瓜品种侵染前后叶片组织中激素、褪黑素、酚酸和氨基酸的变化，研究表明茉莉酸甲酯、茉莉酸-异亮氨酸、褪黑素和赖氨酸可能在防御过程中具有关键作用。HEIDARI等[52]采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用(HPLC-QTOF-MS)技术对不同程度叶斑病抗性甜菜的差异代谢产物进行鉴定，结果表明可以根据代谢产物区分敏感和抗性植株，可以更好地了解植物对病害侵染产生的相应代谢物，有助于培育抗病作物品种。

1.4.2 代谢组学技术在非生物胁迫中的应用 CHEN[53]为探究苹果新生伤口发生后24 h内的代谢变化，采用GC-MS技术共鉴定了36种代谢成分，并阐述了早期生理变化以及刚受伤苹果的代谢机制，提供了促进苹果采后保存和减少其商业价值损失的见解。段二龙等[54]利用GC-MS技术探究在低温胁迫下木兰科植物的代谢特性，以不同品种的玉兰花顶尖为材料分析不同温度下代谢物差异，为抗寒品种的选育和改良提供依据。β-谷甾醇(BS)是一种重要的植物生长调节剂，LI等[55]通过对BS预处理的白三叶草进行7天水分胁迫。从生理反应和代谢组学的角度探讨了BS对白三叶生长和耐水性的影响，为BS诱导的植物生长和耐水性相关的代谢稳态研究提供了一个新的视角。

2 展望

植物病害是世界农业产业经济损失的主要原因。目前植物病害的防治方法主要有：植物免疫、抗病育种、农业防治、化学防治、物理机械防治和生物防治这六种方式[56]。其中抗病育种是一种经济有效的防治方式。其次生物防治也更为环保，通过分泌抗菌物质、诱导系统抗性和提高植株抗逆性的方法来减少植物病害，具有广阔的发展前景[57]。

有研究人员开创了一些新的植物病虫害监测技术，例如差分迁移谱仪和侧流装置转、基于噬菌体显示和生物光子学的生物传感器、遥感技术与基于光谱的方法相结合的技术来辅助基于DNA的血清法，为准确的植物疾病诊断提供了必要的工具[58]。同时，转基因技术可以在植物抗病中发挥重要作用，但监管问题可能会阻碍有效的商业化，虽然组学技术成本相对较高，但是随着科技的发展有望解决这一问题，并且在未来生物防治剂的商业化中发挥重要作用[59]。在植物抗病的蛋白组学研究过程中，仍有一些低丰富度或低分子量的功能蛋白未被成果鉴定，这取决于质谱检测技术的灵敏度，同时一些重要物种基因数据库和植物体内代谢物及病原真菌综合代谢物相关数据库也需要不断的补充和完善[60-61]。

一些新兴技术的出现，以及多组学技术整合分析，为新时代植物病毒相互作用的研究带来了新的契机。随着先进的组学技术不断发展和创新，在植物病害的防治研究过程中大量的数据表明，组学技术在探究植物抗病机理方面具有重要意义。尤其是在抗性物种的培育和改良中，以环境保护为主，提高植物的抗病能力。组学技术的产生和发展，为现代科技发展提供了不竭的动力源泉，为人类探索生命提供了快捷的方式，使人们解决错综复杂的科学难题成为可能。