黄芪甲苷对大鼠肠道缺血再灌注损伤的保护作用

张静

天津市第四中心医院消化内科，天津 300140

临床上多种疾病都可引起肠道的缺血再灌注损伤，例如严重的感染、外伤等，而肠道做为应激的中心器官，其损伤可导致大量炎症介质的释放，这些炎症介质作用于局部或全身，严重时导致全身各脏器功能衰竭［1］，因此如何减轻肠道的缺血再灌注损伤，成为临床工作的热点问题。黄芪是广为人知的一种健脾益气类中药，黄芪甲苷为黄芪的单体皂苷类化合物，研究发现其具有抗炎［2］、抗氧化［3］、减压等作用，也有研究发现其可以维持胃黏膜组织完整［4］，对胃黏膜屏障功能起到保护作用。

本文通过在大鼠肠道组织缺血再灌注损伤前给予黄芪甲苷，观察黄芪甲苷在肠道缺血再灌注损伤中的保护作用，并探讨其发挥这一作用的机制。

材料与方法

1、材料

美国R&D Systems公司的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒［二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸］，武汉博士德生物工程公司的兔抗鼠血管内皮生长因子（VEGF）抗体，成都地奥九泓制药厂的黄芪甲苷。

2、方法

2.1、动物分组及模型制作2017年1月至6月选取健康Wistar雄性大鼠45只，购自军事医学科学院实验动物中心，体质量180～200 g，分为3组：假手术组（A组）、缺血再灌注组（B组）及黄芪甲苷组（C组），每组15只。术前大鼠可自由饮水，禁食12 h。以水合氯醛麻醉大鼠，于腹正中线剖开腹腔，分离出肠系膜前动脉（SAM），夹闭动脉起始部45 min后松开血管夹，于再灌注24 h后处死大鼠并进行取材。A组仅行剖腹术，B组夹闭SAM不予黄芪甲苷处理，C组夹闭SAM前10 min腹腔注射黄芪甲苷6.0 ml·kg-1。

2.2、标本采集及检测手段 各组大鼠缺血再灌注24 h后予以处死，于门静脉取血，离心后取血清，将血清保存于-80℃冰箱。小肠组织冲洗干净后部分浸泡于甲醛中固定，部分保存于-80℃冰箱中。各检测手段：（1）依据ELISA说明书检测血清D-乳酸和DAO水平。（2）取保存于甲醛中的肠道组织制备石蜡包块，切片、烤片、HE染色，观察肠道组织形态学变化。（3）蛋白质印迹法（Western blot）检测肠道组织VEGF蛋白表达量：将留存的肠道组织匀浆后提取总蛋白，将蛋白电泳后行转膜、封闭，滴加一抗，孵育，滴加二抗，孵育，洗膜后显影。

3、统计学处理

全部数据处理均由SPSS 11.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1、各组大鼠一般状态

3组大鼠存活率均为100%，B组大鼠进食水情况不良，皮毛光泽度差，毛发蓬乱，A、C两组大鼠一般情况尚可，大体无明显差异。

2、病理改变

光镜下可以看出B组小肠绒毛结构不完整，破坏严重，肠道间质充血并可见较多炎细胞浸润（图1B）。A组小肠绒毛完整，排列整齐，未见明显炎症细胞及充血坏死（图1A）。C组小肠绒毛结构破坏程度介于A、B两组之间（图1C）。

图1 3组大鼠小肠病理改变（HE染色 ×200）。A为假手术组；B为缺血再灌注组；C为黄芪甲苷组

3、ELISA法检测各组大鼠血清中D-乳酸、DAO水平

B、C两组血清D-乳酸和DAO水平均高于A组，表明肠道缺血再灌注破坏了肠黏膜屏障的通透性，C组中两者水平低于B组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。提示：黄芪甲苷可以减轻肠道缺血再灌注对肠黏膜屏障完整性的损伤。见表1。

表1 3组大鼠血清D-乳酸和DAO的水平（±s）

表1 3组大鼠血清D-乳酸和DAO的水平（±s）

注：A组仅行剖腹术，B组夹闭SAM不予黄芪甲苷处理，C组夹闭SAM前10 min腹腔注射黄芪甲苷6.0 ml·kg-1；DAO为二胺氧化酶，SAM为肠系膜前动脉；与A、B组相比，aP＜0.05

组别A组B组C组n 1515 15 D-乳酸（μg/ml）1.24±0.087.41±1.075.78±0.48a DAO（IU/ml）2.27±0.199.36±1.036.82±0.52a

4、Western blot检测结果

VEGF蛋白水平表达B、C两组高于A组，且两组之间C组表达更高。提示：黄芪甲苷可增强VEGF蛋白的表达水平，从而对肠黏膜屏障起到保护作用。见图2、图3。

图2 3组大鼠小肠VEGF蛋白表达水平（×200）

图3 3组大鼠小肠VEGF蛋白表达水平

讨论

肠道是人体重要的消化器官，也是腹腔各器官中对缺血最敏感的器官，当缺血的肠道恢复血流后，其可以释放大量炎症介质及细胞因子，它们可以破坏肠黏膜屏障功能，导致肠黏膜通透性增高，从而使大量的细菌及内毒素通过破损的肠道进入人体循环，严重时引起全身各脏器的功能障碍。血浆中DAO、D-乳酸浓度可以间接反映肠黏膜通透性及屏障功能，二者可以用来评判肠黏膜上皮细胞的完整性［5］。因为DAO仅存在于肠绒毛中，很少存在于其他细胞中，当肠绒毛遭到破坏时它将大量释放入血，导致其在血浆中活性升高。D-乳酸是细菌的代谢产物，肠黏膜屏障功能受损时，它可以大量释放入血，使其在血浆中浓度增加。有研究发现血浆DAO和D-乳酸的水平与肠黏膜屏障功能呈负相关［6］。本研究证实，肠道缺血再灌注时两者在血浆中的含量增多，表明缺血再灌注破坏了肠黏膜屏障的完整性，导致其通透性增加。

VEGF广泛分布于人和动物的各器官，它是一种可以特异性作用于血管内皮细胞，促进细胞有丝分裂，从而促进新生血管形成的细胞因子，是目前促进血管生成活性最强，专一性最高的因子［7］。它可以促进损伤区域的血管化，恢复损伤组织的血液供应，从而减轻受损组织的缺血缺氧损伤，挽救濒死组织。有研究发现，VEGF可以参与大脑、肾脏［8-9］等器官的缺血损伤修复。本研究发现当肠道缺血再灌注损伤时VEGF蛋白表达水平上调，机体通过增加VEGF蛋白的表达改善肠道的血运，使肠道获取更多的营养物质，从而加快肠黏膜损伤的愈合。

黄芪是益气补血、活血化瘀的一类中药，它具有改善循环、扩张血管、免疫调节等多种作用，广泛应用于各种疾病的治疗。其可通过各种核心靶点，作用于多种信号通路，对糖尿病肾病的发生发展起到一定作用［10］。其中，黄芪甲苷是黄芪的单体皂苷类化合物，是评价黄芪药材质量的指标物质［11］。黄芪甲苷具有促进新生血管形成，保护心肌细胞，改善心功能的作用［12］。徐胜艳等［13］研究发现黄芪甲苷可以抑制结肠炎小鼠的炎性反应，对溃疡性结肠炎小鼠的黏膜组织起到保护作用。另一项研究发现黄芪甲苷不仅可以正向促进新生血管生成，而且可以抑制负向控因子表达，从而发挥促血管生成作用［14］。有研究发现黄芪可以通过促进VEGF蛋白的表达，改善脑组织缺血［15］。黄芪甲苷也可以通过上调VEGF蛋白的表达，增加微血管密度，从而促进心肌梗死大鼠血管生成，表明黄芪甲苷对心肌缺血有改善作用［16］。黄芪可以抑制氧自由基，降低胃黏膜的氧化损伤，可以提高VEGF水平，促进胃溃疡的愈合［17］。

本实验发现，与单纯缺血再灌注组比较，黄芪甲苷预处理组大鼠肠屏障通透性减低，VEGF蛋白表达水平明显升高。表明黄芪甲苷对肠道缺血再灌注损伤具有保护作用，原因可能与它可以调节VEGF蛋白的表达水平有关，这可能是黄芪治疗肠道缺血再灌注损伤的机制之一，但其确切机制有待进一步研究。

本研究为临床上应用黄芪治疗各种缺血性疾病提供了一个有用的理论依据，相信随着研究的不断深入，将会不断发掘黄芪的更多功效，使其更好地服务于临床。

利益冲突作者声明不存在利益冲突