甘草酸二胺对CRP/TGF-β介导的慢性肝炎性纤维化的作用研究

黄小区 苏美霞 杨世春 蔡杰 潘洁婷

1湛江中心人民医院药学部药库，湛江 524000；2湛江中心人民医院药学部临床药学，湛江 524000；3湛江中心人民医院药学部西药房，湛江 524000；4湛江中心人民医院药学部，湛江 524000

慢性肝炎性纤维化是因不同慢性疾病所致肝脏持续受损而造成的肝脏中纤维结缔组织异常增生，而肝细胞外基质大量积滞是诱发肝纤维的主要病理机制；随纤维化进展，易出现肝硬化、肝衰竭，严重者甚至肝癌，因此抗肝炎性纤维化治疗对控制患者病情发展或逆转病理过程具有重要意义［1-2］。临床研究发现，C反应蛋白（C reactive protein，CRP）主要在肝脏中表达，作为炎性标志物参与大量慢性疾病的发生进展，激活补体加快机体炎症变化，而炎症在肝纤维化发生发展中发挥至关重要的作用［3-4］。高炎症表达所诱导的肝纤维化与肝星形细胞激活密切，而转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）参与调控纤维化发展，与细胞膜结合作用后刺激细胞中因子从而加快胶原代谢，促进纤维化发生［5-6］。有研究报道，具有抗炎症及纤维化作用的药物对CRP/TGF-β活化具有抑制作用［7-8］。

甘草酸二胺为主的甘草酸剂是临床广泛应用的抗炎保肝药物，其主要成分为甘草［9］。临床已报道，其对多种肝毒剂与复合致病因子导致的肝脏损伤具有治疗作用，对肝细胞膜具有一定的保护作用［10］。但该药的作用机制不明，是否通过介导CRP/TGF-β缓解纤维化未见报道，基于此，本研究旨在探讨甘草酸二胺对CRP/TGF-β介导的慢性肝炎性纤维化的作用。

材料与方法

1、实验动物

选取SPF级SD大鼠50只，8周龄，体质量（200±20）g/只，许可证号：SCXK（粤）2021-009。适应环境7 d后开始实验。分为对照组、模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只。

2、试剂与仪器

甘草酸二胺［华润双鹤利民药业（济南）有限公司］、刀豆蛋白A（上海信乎生物科技有限公司）、CRP酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、层粘连蛋白（LN）ELISA试剂盒、透明质酸（HA）ELISA试剂盒、Ⅰ型胶原蛋白（PCⅠ）ELISA试剂盒、PCⅢELISA试剂盒、苏木精-伊红（HE）染色液均购自麒盟（上海）生物医学有限公司、谷丙转氨酶（ALT）检测试剂盒、谷草转氨酶（AST）检测试剂盒、RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、聚合酶链反应（PCR）试剂盒均自西格玛奥德里奇（上海）贸易、CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ一抗、二抗均购自北京百奥莱博科技有限公司。低温高速离心机（KS50R，湖南凯达科学仪器有限公司）、微型垂直电泳槽（VE-180，上海天能科技有限公司）、酶标仪（SuPerMax 3100，上海闪谱生物有限公司）。

3、造模与给药

模型组、高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠进行肝纤维化造模，给予12.5 mg/kg剂量的刀豆蛋白A磷酸缓冲盐溶液300 μl经大鼠尾静脉注射，每周1次，注射4周。造模完成后，从模型组中随机抽取1只大鼠处死，参考《病毒性肝炎防治方案》［11］中肝纤维化分期来评估大鼠是否造模成功，如大鼠肝组织中见2期以上肝纤维化，则表明造模成功。造模成功后高剂量组给予甘草酸二胺60 mg/kg、中剂量组给予甘草酸二胺40 mg/kg、低剂量组给予甘草酸二胺20 mg/kg（上述剂量采用体表面积换算后相当于2.0倍、1.0倍及0.5倍临床用药剂量），在造模的同时每天进行药物灌胃治疗1次，而对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃，总共4周。

4、标本采集

在4周末最后1次灌胃结束后，对大鼠禁食12 h后采取腹主动脉血，分离获取上层血清保存于-20℃中备用；取肝左叶组织，一部分制成匀浆待检，一部分用10%甲醛溶液固定待检。

5、大鼠肝组织病理形态学观察

取部分待检肝组织进行石蜡包埋后切片（4 μm大小），采取HE染色，并在光学显微镜下观察肝病理组织形态改变，拍照记录。

6、血清CRP、ALT、AST及纤维化相关指标检测

采用ELISA试剂盒检测CRP；用试剂盒检测ALT、AST水平及纤维化相关指标（HA、LN、PCⅠ、PCⅢ）含量，参考试剂盒说明书进行基本操作。

7、PCR检测肝组织CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA表达情况

取部分待检肝组织，采用RNA提取试剂盒进行RNA提取，然后cDNA第一链合成试剂盒配置反转录体系转录为cDNA，采用PCR试剂盒配置PCR反应体系，对CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ、β肌动蛋白基因（β-actin）cDNA进 行PCR反 应，以β-actin为 内参，按 照 公式2-△△ct计算CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA表达量。

8、Western blot法检测肝组织CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白表达情况

取部分待检肝组织，将组织中蛋白采用RIPA裂解液进行提取，应用BCA法检测当中的蛋白总量，同时取30 μg蛋白与上样缓冲液充分混合后，在高温环境下变性同时对蛋白行电泳分离，把蛋白电转移到PVDF膜中，给予5%脱脂牛奶在常规室内温度下在PVDF膜下封闭1 h，将CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ一抗按照1∶1000进行稀释，并在4℃PVDF膜过夜，次日1∶2000稀释二抗室温孵育PVDF膜1 h，最后在凝胶成像仪中读取蛋白条，按照蛋白条吸光值，以β-actin为内参，计算CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白表达。

9、统计学方法

采用SPSS 20.0软件录入数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

结果

1、甘草酸二胺对肝纤维化模型大鼠肝组织病理形态学的影响

对照组大鼠肝纤维化结构正常，肝索整齐排列；模型组大鼠肝小叶结构紊乱，纤维组织伴增生结构，已出现少数假小叶；低剂量组、中剂量组及高剂量组随药物剂量增加，肝组织损伤较模型组显著减轻。见图1。

图1 甘草酸二胺对肝纤维化模型大鼠肝组织病理形态学的影响（HE×200）。对照组（A）与模型组（B）给予等量生理盐水灌胃，低剂量组（C）采用甘草酸二胺20 mg/kg灌胃，中剂量组（D）采用甘草酸二胺40 mg/kg灌胃，高剂量组（E）采用甘草酸二胺60 mg/kg灌胃

2、甘草酸二胺对血清CRP、ALT、AST水平的影响

与对照组相比，模型组CRP、ALT、AST水平均显著升高（均P＜0.05）；与模型组比较，随剂量增加低剂量组、中剂量组、高剂量组CRP、ALT、AST明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 甘草酸二胺对大鼠血清CRP、ALT、AST水平的影响（±s）

表1 甘草酸二胺对大鼠血清CRP、ALT、AST水平的影响（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与高剂量组比较，dP＜0.05；高剂量组采用甘草酸二胺60 mg/kg灌胃，中剂量组采用甘草酸二胺40 mg/kg灌胃，低剂量组采用甘草酸二胺20 mg/kg灌胃，对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃；CRP为C反应蛋白，ALT为谷丙转氨酶，AST为谷草转氨酶

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组F值P值n 1010 1010 10 CRP（mg/L）7.34±1.19121.98±1.37a 87.20±1.29b 53.19±1.23bcd 18.29±1.20bc 99.077＜0.001 ALT（U/L）48.32±16.92169.31±20.31a 112.87±19.28b 87.29±18.78bcd 57.92±17.38bc 68.502＜0.001 AST（U/L）29.28±18.12163.08±25.97a 139.98±23.09b 102.35±21.34bcd 78.98±19.87bc 57.565＜0.001

3、甘草酸二胺对肝纤维化相关指标的影响

与对照组相比，模型组HA、LN、PCⅠ、PCⅢ水平均显著升高（均P＜0.05）；与模型组比较，随剂量增加低剂量组、中剂量组、高剂量组HA、LN、PCⅠ、PCⅢ水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2 甘草酸二胺对大鼠肝纤维化相关指标的影响（±s）

表2 甘草酸二胺对大鼠肝纤维化相关指标的影响（±s）

注：高剂量组采用甘草酸二胺60 mg/kg灌胃，中剂量组采用甘草酸二胺40 mg/kg灌胃，低剂量组采用甘草酸二胺20 mg/kg灌胃，对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃。HA为透明质酸，LN为层粘连蛋白，PCⅠ为Ⅰ型胶原蛋白；PCⅢ为Ⅲ型胶原蛋白。与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与高剂量组比较，dP＜0.05

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组F值P值n 1010 1010 10 HA（mg/L）7.98±1.2317.39±1.39a 14.27±1.28b 10.31±1.27bcd 8.38±1.25bc 99.539＜0.001 LN（μg/L）73.20±11.08119.34±14.98a 102.47±13.37b 82.37±12.84bcd 78.39±12.06bc 22.196＜0.001 PCⅠ（μg/L）8.09±1.5727.46±2.05a 22.98±1.82b 16.62±1.72bcd 10.35±1.68bc 213.251＜0.001 PCⅢ（μg/L）9.07±1.6929.91±2.17a 23.23±1.79b 17.45±1.78bcd 12.57±1.72bc 205.478＜0.001

4、甘草酸二胺对CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA表达的影响

与对照组相比，模型组CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA均显著升高（均P＜0.05）；与模型组比较，随剂量增加，低剂量组、中剂量组、高剂量组CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

表3 甘草酸二胺对大鼠CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA表达的影响

5、甘草酸二胺对CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白均显著升高（均P＜0.05）；与模型组比较，随剂量增加，低剂量组、中剂量组、高剂量组CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表4、图2。

图2 甘草酸二胺对大鼠CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白的电泳图

表4 甘草酸二胺对大鼠CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢ蛋白表达的影响

讨论

慢性肝炎性纤维化是由于慢性、持续的细胞外基质损伤，部分纤维化形成瘢痕组织代替肝实质而出现无法逆转的肝纤维化，进一步发展为肝硬化、肝衰竭甚至肝癌［11-13］。在机体持续炎症及应激状态下，肝星状细胞从静息状态被激活，成为肌成纤维细胞具有可复制性，同时可刺激大量细胞外基质，如纤维连接蛋白与细胞因子，如TGF-β产生；控制炎症及细胞外基质产生是减轻对肝星状细胞刺激，可能是缓解肝纤维化的重要通路［15-17］。

甘草酸二胺主要成分为甘草，而甘草酸中皂苷类成分丰富；目前已有临床发现甘草酸可抵御炎症、抗病毒、抗肺部纤维化及提高免疫功能等效果［18-20］。故本研究旨在探讨甘草酸二胺对慢性肝炎性纤维化的应用效果及介导的分子靶向机制。本实验中发现，随甘草酸二胺剂量增加，大鼠肝脏纤维化病理显著改变，提示甘草酸二胺可改善大鼠肝纤维化，而与黄坤等［21］学者报道甘草酸二胺对大鼠肺纤维化有协同作用结论相符。肝纤维化发展时，CRP异常刺激补体系统加快炎症进展，使肝细胞损伤大量分泌ALT、AST；在胶原代谢异常时，纤维结缔组织中出现大量增生，刺激HA、LN、PCⅠ、PCⅢ合成与释放［22-23］。本结果中观察到，与对照组相比，模型组CRP、ALT、AST、HA、LN、PCⅠ、PCⅢ水平均显著升高（均P＜0.05）；与模型组比较，随剂量增加低剂量组、中剂量组、高剂量组CRP、ALT、AST、HA、LN、PCⅠ、PCⅢ水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），提示甘草酸二胺可缓解肝损伤，使肝纤维化程度减轻，与HE染色观察到的肝组织病理改变相符。

TGF-β异常表达可介导肝纤维化进展，可靶向作用下游Smad2/Smad3通路刺激肝星状细胞，诱导下游蛋白酶与抑制物表达变化并加快肝纤维化发生［24-27］。临床发现，甘草酸二胺可抑制TGF-β的调控过程而改善腹膜纤维化进展［28-29］。本结果观察到：与对照组相比，模型组CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA及蛋白表达均显著升高（均P＜0.05）；与模型组比较，随剂量增加低剂量组、中剂量组、高剂量组CRP、TGF-β、LN、PCⅠ、PCⅢmRNA及蛋白表达量显著降低（均P＜0.05），表明肝纤维化大鼠肝脏伴高炎症状态且TGF-β通路被激活，而给予甘草酸二胺可抑制CRP、TGF-β通路，下调LN、PCⅠ、PCⅢ等蛋白的表达，进一步改善大鼠肝纤维化。

综上所述，本研究验证在慢性肝炎纤维化发展过程中，肝脏组织及血清处于高炎症状态且TGF-β活化，而随着甘草酸二胺剂量增加，CRP、TGF-β表达逐渐降低，且可能是通过调控CRP、TGF-β发挥抗炎症作用与控制细胞外基质分泌。初步揭示了CRP、TGF-β在慢性肝炎性纤维化发展中的作用，为该疾病预防及治疗提供新的靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突