降脂1号对高脂血症模型大鼠小肠及Caco-2细胞胆固醇代谢的影响

潘秋，闫玉冰，田聪阳，张志清，于彤，柴欣楼，杨然

1.北京中医药大学中医学院，北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院，北京 100091；3.中国医科大学航空总医院，北京 100012；4.中国中医科学院广安门医院，北京100053

高血脂引发的动脉粥样硬化及冠心病等成为老年人致死的主要原因，胆固醇作为脂代谢过程的重要部分，被认为是疾病进展的重要影响因素，降胆固醇药物的研究是当今医学研究的热点问题之一。迄今为止，批准上市的抑制胆固醇吸收药物只有依折麦布，其与他汀类药物联合应用相比单一使用他汀类药物可以更好地降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，但药物联用往往会增加肝功能损伤及肌痛等不良反应发生率。

降脂1号是本课题组从名老中医郭维琴临床经验方中提炼的处方，具有活血消食、祛湿健脾功效，临床用于治疗高胆固醇血症，但其具体作用机制尚未明确。本实验采用高脂乳剂诱导建立高脂血症大鼠模型及Caco-2细胞脂质蓄积模型，以小肠为切入点，从胆固醇摄取及排出2个环节探讨其作用机制，为降脂1号的进一步开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞

8 周龄SPF 级雄性SD 大鼠48 只，体质量（180±20）g，斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，生产许可证号SCXK（京）2019-0010。常规饲养于北京中医药大学清洁级动物房，（温度22±2）℃、12 h明暗交替，自由进食饮水，使用许可证号SYXK（京）2019-0010。本实验由北京中医药大学实验动物伦理委员会审批。人结直肠腺癌细胞Caco-2细胞株购自北京协和细胞资源中心。

1.2 药物及制备

降脂1号颗粒由中日友好医院制剂室提供，灌胃前用去离子水稀释溶解；细胞实验前用去离子水稀释，并于超净工作台内用0.22 μm滤膜过滤除菌分装，-20 ℃冰箱冻存备用。阿托伐他汀片，辉瑞制药有限公司，批号20140326，20 mg/片，将药片粉碎，使用蒸馏水溶解，制成浓度为1.05 mg/mL溶液。丙硫氧嘧啶片，国药集团化学试剂有限公司，批号1021045，50 mg/片。依折麦布片，默沙东（中国）有限公司，批号20160181，10 mg/片。

1.3 主要试剂与仪器

ATP结合盒转运蛋白G5（ABCG5）兔多克隆抗体（美国Proteintech 公司，批号27722-1-AP），NPC1L1多克隆抗体（美国Thermo公司，批号PA1-16800），超敏二步法免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号PV-9002），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZLI-9018），DAPI染色液（北京Solarbio，批号C0065）。120全自动生化分析仪（日本东芝），D-37520 高速离心机（德国Sigma），RM2235切片机（德国Leica），G1150H石蜡包埋机（德国Leica），CJT-E-Ⅱ超净工作台（北京市昌平长城空气净化设备公司）。

1.4 分组、造模及给药

大鼠适应性喂养2周后开始实验，48只大鼠随机分为对照组、模型组、阿托伐他汀组和降脂1号低、中、高剂量组，每组8只。高脂乳剂按照课题组前期方法配制：猪油30 g、胆固醇5 g、蛋黄粉5 g、丙硫氧嘧啶0.5 g、吐温-80 4 mL，加蒸馏水定容至100 mL，80 ℃水浴搅拌充分溶解形成高脂乳剂。对照组予蒸馏水灌胃，其余各组每日固定时间按2 mL/kg予高脂乳剂灌胃，共6周。造模第2周开始给药，给药剂量按人与大鼠体表面积进行计算，降脂1号低、中、高剂量组分别为0.37、1.1、3.3 g/kg（相当于临床等效剂量的1/3、1、3倍），阿托伐他汀组为2.1 mg/kg，灌胃体积2 mL/kg，每日1次，连续6周。

1.5 取材

末次给药结束后大鼠禁食不禁水12 h，称量体质量，10%水合氯醛腹腔注射（5 mL/kg）麻醉，腹主动脉取血，用于血脂及肝肾功能指标检测。取小肠组织，预冷生理盐水冲净，迅速置于4%多聚甲醛中固定。

1.6 细胞培养与分组

Caco-2 细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素的完全培养基于37 ℃、5%CO培养箱中培养。取对数生长期细胞（约第5日），加入胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀加完全培养基重悬，细胞计数后调节细胞密度为1×10～1×10个/mL，将细胞悬液接种至12孔Transwell板，每孔接种细胞1×10个，加入完全培养基培养，接种后第1周隔日更换培养基，1周后每日更换培养基，至第21日细胞分化成熟，将细胞分为对照组、模型组、依折麦布组和降脂1号低、中、高浓度组。

1.7 细胞造模与给药

对照组细胞用不含胎牛血清的培养基培养，模型组细胞用含10%胎牛血清的完全培养基培养，依折麦布组和降脂1号低、中、高浓度组分别在模型组基础上加入依折麦布和低、中、高浓度降脂1号同时处理24 h。根据CCK8预实验结果，降脂1号低、中、高浓度分别为0.3、0.6、1.2 mg/mL，依折麦布浓度为50 μmol/L。

1.8 指标检测

1.8.1 一般情况

每日观察大鼠毛色、状态，每周测量大鼠体质量。

1.8.2 血脂及肝肾功能指标检测

采用全自动生化分析仪检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）水平，本实验由北京中医药大学中医药研究院完成。

1.8.3 HE染色

将固定后的小肠组织从4%多聚甲醛中取出，蒸馏水冲洗过夜，脱水机梯度脱水，石蜡包埋，切片（5 μm），常规HE染色，光镜下观察小肠组织病理变化。

1.8.4 免疫组化检测

小肠组织石蜡切片脱蜡至水，微波炉加热修复抗原，流水冲洗，10%山羊血清室温孵育30 min，滴加ABCG5 一抗（1∶500）、NPC1L1 一抗（1∶100），37 ℃孵育1 h，滴加二抗，室温孵育30 min，全自动封片机封片，光学显微镜下观察，以棕黄色颗粒为阳性表达。应用ImageJ1.53e图像分析软件，根据阳性染色面积和强度计算平均光密度（MOD）。MOD＝积分光密度÷染色面积。

1.8.5 免疫荧光检测

用6孔板制作细胞爬片，造模及加药处理后，收集细胞，将Caco-2 细胞悬液滴至爬片上，放入37 ℃、5%CO培养箱内培养，待细胞贴壁后，滴加培养基继续培养，待细胞完全贴满爬片时，取出细胞爬片放入细胞培养皿，加入4%多聚甲醛室温固定，分别滴加ABCG5 一抗（1∶200）、NPC1L1 一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜，滴加荧光二抗，室温孵育1 h，DAPI复染，封片，共聚焦显微镜下观察并拍照。应用Image J 1.53e图像分析软件，计算平均荧光强度（累计荧光强度÷染色面积）。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 降脂1号对模型大鼠一般情况的影响

对照组大鼠毛色洁净有光泽，行动灵活，精神状态良好，体质量有所增加；模型组大鼠毛色干黄无泽，活动减少，形体逐渐消瘦；阿托伐他汀组大鼠形体更加消瘦；降脂1号低、中、高剂量组大鼠毛色黄而少泽，形体消瘦有所好转。实验过程中，因麻醉过量及灌胃不当，共有14只大鼠死亡。

2.2 降脂1号对模型大鼠血脂及肝肾功能指标的影响

血脂检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠TC、LDL-C水平明显升高（＜0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组与降脂1号各剂量组大鼠TC、LDL-C水平明显降低（＜0.05，＜0.01）。各组大鼠TG、HDL-C差异无统计学意义（＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血脂水平比较（，mmol/L）

肝肾功能指标检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠ALT、BUN、SCr水平明显升高（＜0.01）；与模型组比较，降脂1号高剂量组大鼠ALT水平明显降低（＜0.05），降脂1号中、高剂量组大鼠BUN水平明显降低（＜0.01），阿托伐他汀组和降脂1号低、高剂量组大鼠SCr水平明显降低（＜0.01）。各组大鼠AST差异无统计学意义（＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肝肾功能指标比较（）

2.3 降脂1号对模型大鼠小肠组织病理变化的影响

对照组大鼠小肠肌层完整，上皮隐窝及绒毛排列整齐，刷状缘整齐；模型组大鼠小肠局部肌层较薄，相邻绒毛融合，间隙变宽，排列疏松有缺失，部分腺体碎裂；阿托伐他汀组大鼠小肠相邻绒毛融合变宽，排列疏松有缺失，部分腺体碎裂；降脂1号低、中剂量组大鼠小肠绒毛排列较模型组和阿托伐他汀组紧密、规则，绒毛高度有所恢复，相邻绒毛融合较少；降脂1号高剂量组大鼠小肠相邻绒毛部分融合，排列略疏松，部分上皮细胞脱落，部分腺体碎裂。见图1。

图1 各组大鼠小肠组织形态（HE染色，×20）

2.4 降脂1 号对模型大鼠小肠组织ATP 结合盒转运蛋白G5、NPC1L1表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠小肠组织ABCG5表达降低，NPC1L1表达升高，但差异无统计学意义（＞0.05）；与模型组比较，降脂1号低剂量组大鼠小肠组织NPC1L1表达明显降低（＜0.05），降脂1号各剂量组大鼠小肠组织ABCG5表达升高，但差异无统计学意义（＞0.05）。见图2、图3、表3。

表3 各组大鼠小肠组织ABCG5、NPC1L1蛋白表达比较［M（Q1，Q3），MOD］

图2 各组大鼠小肠组织ABCG5阳性表达（免疫组化染色，×20）

图3 各组大鼠小肠组织NPC1L1阳性表达（免疫组化染色，×20）

2.5 降脂1号对Caco-2细胞ATP结合盒转运蛋白G5、NPC1L1蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组细胞ABCG5、NPC1L1表达明显升高，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，降脂1号高浓度组细胞ABCG5表达明显升高，NPC1L1表达明显降低，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01），见图4、图5、表4。

图4 各组Caco-2细胞ABCG5阳性表达（免疫荧光染色，×20）

图5 各组Caco-2细胞NPC1L1阳性表达（免疫荧光染色，×20）

表4 各组Caco-2细胞ABCG5、NPC1L1蛋白表达比较（，平均荧光强度）

3 讨论

LDL-C和TC水平升高是动脉粥样硬化性心血管疾病重要的危险因素。中药复方可以通过多组分、多靶点、多通路干预血脂代谢，从而实现安全有效调脂的目的。本课题组以小肠胆固醇代谢为切入点，发现降脂1号可有效降低高脂血症大鼠血脂水平，并且具有良好的肝肾保护作用，可明显改善小肠病变程度，恢复小肠吸收、排出胆固醇平衡，从而达到有效降脂的目的。

本实验过程中模型组及给药组大鼠体质量增长缓慢，丙硫氧嘧啶可明显减少大鼠进食量和体质量，灌胃高脂乳剂后进食量进一步减少，而体质量可小幅回升。有报道，给予大鼠0.2%丙硫氧嘧啶灌胃可导致LDL-C、TC、TG、HDL-C水平升高，与本实验结果不完全一致，考虑可能是本实验配制的丙硫氧嘧啶浓度偏高，对甲状腺抑制作用更明显，大鼠进食及消化功能明显趋缓，脂质代谢受到影响，TG水平不升反降。本实验发现，降脂1号各剂量组大鼠体质量可缓慢增加，推测可能与降脂1号缓解丙硫氧嘧啶所致大鼠甲状腺功能减退有关。

小肠在脂类代谢过程中与肝脏协同分工发挥作用。HE染色发现，模型大鼠小肠组织明显损伤，小肠相邻绒毛融合，间隙变宽，排列疏松，部分腺体碎裂。降脂1号可显著改善小肠病理形态，为发挥降脂作用提供必要的结构基础。

NPC1L1在多个组织中广泛表达，尤其在肝脏和小肠中高表达。NPC1L1能促进小肠上皮细胞摄取胆固醇，当细胞内胆固醇含量降低时，NPC1L1将移动至细胞膜侧，参与胞外胆固醇摄取进入细胞。动物实验结果发现，降脂1号能降低模型大鼠小肠组织NPC1L1蛋白表达，其中低剂量组效果最明显，说明减少小肠吸收胆固醇是降脂1号发挥降脂作用的重要环节之一。ABCG5/G8 属于ATP 结合盒转运蛋白半转运体，ABCG5/G8结合成异二聚体，其主要功能是将被摄取进入小肠上皮细胞的胆固醇逆向转运回肠腔。本实验中，虽然各组大鼠小肠组织ABCG5蛋白表达无明显差异，但降脂1号各剂量组ABCG5蛋白表达均有升高趋势，其中低剂量组最明显，提示降脂1号可促进小肠排出胆固醇，降低血脂水平。在细胞实验中，降脂1号高浓度组细胞ABCG5表达明显降低，与动物实验结果不一致。我们认为，这可能与大鼠实验采用丙硫氧嘧啶灌胃有关。研究表明，临床或亚临床甲状腺功能减退可显著改变血脂水平，多数高脂血症患者伴有甲状腺功能障碍。提示甲状腺功能减退可能影响大鼠肠道胆固醇代谢功能，进而导致胆固醇流出受损。

经肠胆固醇排泄（TICE）是小肠的另一种外排机制，即胆固醇由血直接经肠道分泌和排出体外。有研究表明，依折麦布诱导的TICE大多由ABCG5/G8介导，TICE在人体中很活跃，可能是刺激心血管疾病风险患者消除胆固醇的新靶点。课题组前期预实验发现，肝脏在胆固醇摄取及流出方面亦发挥积极作用，本实验中各给药组大鼠血清胆固醇水平明显下降，我们推测肝脏在调节胆固醇代谢方面的正向作用减轻了肠道ABCG5/G8外排胆固醇的负担，但需进一步实验验证。

综上所述，降脂1号能够降低高脂血症大鼠血脂水平，低剂量用药即可减轻小肠病理损伤，推测其机制可能与抑制小肠胆固醇吸收、促进小肠胆固醇排出有关，其内在的相互作用机制有待进一步研究。本研究为指导临床用药及药物进一步开发提供了实验依据。