复方柴金解郁片对慢性温和不可预知性应激抑郁大鼠海马突触可塑性的影响

韩远山，李萍，王宇红，李姿蓉，邹蔓姝，李春艳，牟晴蕊

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙410208

抑郁症是一类以持续情绪低落、思维迟缓、意志力减退为临床表现的精神类疾病，为发作性疾病，可单次或反复发作。据统计，抑郁症在中国的患病率约为3.02%，是全球疾病负担的主要原因之一，预计在2030年将上升至世界疾病负担首位。研究表明，海马突触可塑性改变与抑郁症密切相关，其中胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和树突棘素（Spinophilin）对于调控海马突触可塑性意义重大。课题组前期研究显示，复方柴金解郁片治疗抑郁症肝郁脾虚证效果肯定，不良反应少，安全性较高。药理研究表明，复方柴金解郁片通过降低海马神经元突触素-α和突触素后致密物-95蛋白和mRNA表达、减少炎症因子分泌，促进海马神经元突触损伤修复，发挥抗抑郁作用。本研究采用慢性温和不可预知性应激结合孤养建立抑郁大鼠模型，观察复方柴金解郁片对模型大鼠海马神经元突触可塑性的影响，进一步明确其作用机制，为后续研究奠定基础。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠70只，体质量180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号1107272011006598，生产许可证号SCXK（湘）2019-0004。饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，使用许可证号SYXK（湘）2019-0009，室温（24±2）℃，相对湿度（50±5）%，光暗周期12 h，自由摄食饮水。

1.2 药物

复方柴金解郁片浸膏（柴胡、贯叶金丝桃、姜黄、紫苏叶、白芍、知母），湖南中医药研究院提供，每克浸膏相当于3.92 g原药材，临用前用蒸馏水稀释成浓度分别为1.134、0.567、0.284 g/mL。盐酸文拉法辛缓释胶囊，苏州惠氏制药有限公司，75 mg/粒，批号T37944D，临用前用蒸馏水配制成浓度为1.35 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

GDNF抗体，英国Abcam公司，批号GR279460-6；Spinophilin抗体，江苏亲科生物科技有限公司，批号76m9086；GAPDH 抗体，北京博奥森，批号BJ09 211758；BCA蛋白定量检测试剂盒、凝胶制备试剂盒、HRP标记山羊抗兔IgG，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为G2026、G2003、GB23303。YLS-9A电子刺激仪，济南益延科技有限公司；JJ-12J脱水机、JB-P5包埋机、JB-L5冻台，武汉俊杰电子有限公司；RM2016 病理切片机，上海徕卡；Eclipse E100正置光学显微镜、DS-U3成像系统，日本尼康公司；RT-6100酶标仪，美国Rayto公司；WGXYQ0004封口机，武汉赛维尔生物科技有限公司；6300化学发光仪，上海勤翔科学仪器有限公司；CRYOSTAR NX50 冰冻切片机，美国Thermo 公司；Pannoramic 250数字切片扫描仪，匈牙利3DHistech公司。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

大鼠适应性饲养3 d后进行糖水消耗实验。将糖水消耗量接近的60只大鼠随机分为空白组、模型组、文拉法辛组和复方柴金解郁片高、中、低剂量组，每组10 只。除空白组外，其余各组大鼠均单笼饲养，采用慢性温和不可预知性应激复制抑郁模型，应激因素包括：电击1 min，夹尾1 min，4 ℃冰水浴4 min，昼夜颠倒24 h＋潮湿垫料，禁食24 h，禁水24 h，倾笼45°24 h＋噪音4 h，每种应激方式3 d 内不重复出现。造模同时，文拉法辛组按13.5 mg/kg灌胃给药，复方柴金解郁片高、中、低剂量组按11.34、5.67、2.84 g/kg 灌胃相应药液，灌胃体积10 mL/kg，空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水，连续42 d。

2.2 行为学实验

2.2.1 糖水消耗实验

第28日和第42日灌胃1 h后进行糖水消耗实验，每次糖水消耗实验持续4 d。实验第1日，单笼左右两侧均放置1%糖水瓶；第2日上午将左侧换为蒸馏水瓶，下午将左右两侧水瓶交换位置；第3日禁水24 h；第4日称量两水瓶质量，左侧放置糖水瓶，右侧放置蒸馏水瓶，30 min后将两水瓶位置互换，计时30 min，将两水瓶取下，称重，计算1 h 内大鼠糖水偏好度。糖水偏好度（%）＝糖水摄入量÷（糖水摄入量＋蒸馏水摄入量）×100%。

2.2.2 旷场实验

第28 日和第42 日，将旷场箱（80 cm×80 cm×40 cm）底面划分为5×5的小方格，将大鼠从旷场箱中心放入，适应30 s后，观察记录大鼠4 min内水平活动次数（三爪进入方格）和垂直活动次数（两前肢腾空或攀爬箱壁），水平活动次数和垂直活动次数总和为总活动次数。

2.2.3 强迫游泳实验

第28日和第42日，采用直径20 cm、高50 cm的透明圆柱形水缸，装入适量常温水，将大鼠头部朝下放入水缸中，适应30 s后，观察并记录大鼠4 min内游泳不动时间（大鼠漂浮在水面，四肢没有明显活动或有轻微活动，仅为保持头露出水面，而没有水平位移）。

2.3 取材

第42日行为学实验结束后，大鼠禁食不禁水12 h，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，各组取6只大鼠，腹主动脉取血，冰盒上剥离全脑后分离海马，置于液氮中保存备用。剩余4只大鼠先后心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛溶液，待大鼠四肢僵硬后取全脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，室温保存。

2.4 HE染色

将海马组织修复平整后脱水浸蜡，包埋，切片（4 μm）；将切片依次放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、无水乙醇Ⅰ5 min、无水乙醇Ⅱ5 min、75%酒精5 min，自来水洗；常规HE染色，脱水封片后显微镜下观察。

2.5 高尔基染色

取固定于4%多聚甲醛溶液中的脑组织，沿冠状面切取交叉视神经根部与脑四叠体之间部分，切成2～3 mm组织块，生理盐水漂洗，高尔基染液将脑组织完全浸没，避光处理14 d；蒸馏水浸洗3次，80%冰醋酸浸泡过夜，待组织变软后蒸馏水浸洗，置于30%蔗糖溶液中，低温避光脱水2 d；将组织切成100 μm薄片，贴于明胶玻片上，避光晾干，浓氨水处理15 min，蒸馏水洗1 min，酸性坚膜定影液处理15 min，蒸馏水洗3 min，晾干，甘油明胶封片后显微镜下观察。

2.6 Western blot检测

取适量海马组织，加入裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度；加入适量上样缓冲液，95 ℃加热5 min使蛋白变性；根据蛋白分子量对应范围配制分离胶，上样，60 V电泳至浓缩胶与分离胶分界处，80 V电泳至溴酚兰到达分离胶底部；转膜后5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜，加入GDNF、Spinophilin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜后，滴加二抗（1∶5 000），室温孵育30～60 min；TBST洗膜，ECL法显色，使用Image J 软件测量各条带灰度值，以GAPDH为内参，计算蛋白相对表达量。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 复方柴金解郁片对模型大鼠行为学指标的影响

与空白组比较，模型组大鼠第28、42日糖水偏好度显著降低，总活动次数减少，游泳不动时间显著增加，差异均有统计学意义（＜0.05，＜0.01）；与模型组比较，文拉法辛组大鼠第28、42日糖水偏好度显著升高，总活动次数显著增加，第42日游泳不动时间显著减少，复方柴金解郁片高剂量组大鼠第28日糖水偏好度显著升高，总活动次数显著增加，游泳不动时间显著减少，复方柴金解郁片中、低剂量组大鼠第42日糖水偏好度显著升高，总活动次数显著增加，游泳不动时间显著减少，差异均有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠行为学比较（）

3.2 复方柴金解郁片对模型大鼠海马组织病理形态的影响

空白组大鼠海马锥体细胞形态规则，排列整齐密集，胞核大而圆，核仁清晰，细胞质丰富，未见明显炎性改变；模型组大鼠海马CA1区、DG区锥体细胞胞核固缩，形状不规则，出现炎症改变；文拉法辛组和复方柴金解郁片高、中、低剂量组大鼠海马CA1区、DG区可见少量海马锥体细胞胞核固缩，未见明显炎症改变，病变范围较模型组减少。见图1。

图1 各组大鼠海马组织形态（HE染色，×400）

3.3 复方柴金解郁片对模型大鼠海马神经元病理损伤的影响

空白组大鼠海马神经元较多，树突较长且分支丰富；模型组大鼠海马CA1、DG区部分神经元消失，树突分散、排列疏松或缠搅，树突棘数量减少或缺失，以海马DG区损伤最显著；文拉法辛组和复方柴金解郁片高、中、低剂量组大鼠海马神经元突触损伤有所改善，树突棘和树突分支数量增加。见图2。

图2 各组大鼠海马树突棘形态（高尔基染色，×400）

3.4 复方柴金解郁片对模型大鼠海马组织胶质细胞源性神经营养因子和树突棘素蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马组织GDNF、Spinophilin 蛋白表达显著降低（＜0.05，＜0.01）；与模型组比较，文拉法辛组和复方柴金解郁片中、低剂量组大鼠海马组织GDNF、Spinophilin蛋白表达显著升高（＜0.05，＜0.01），复方柴金解郁片高剂量组大鼠海马组织GDNF蛋白表达显著升高（＜0.01）。见图3、表2。

图3 各组大鼠海马组织GDNF、Spinophilin蛋白免疫印迹

表2 各组大鼠海马组织GDNF、Spinophilin蛋白表达比较（）

4 讨论

抑郁症机制目前广泛认可的有炎症反应学说、单胺类神经递质及其受体学说、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能失调学说、神经营养因子学说等，多种因素通过不同信号途径、生理病理过程相互作用，最终导致突触数量减少和功能损伤，以致发生抑郁。海马与学习、记忆、行为和情绪密切相关，是抑郁症研究的关键靶器官。前期研究表明，复方柴金解郁片对抑郁大鼠海马神经元突触功能及结构损伤具有改善作用。本实验通过行为学、病理学、分子生物学检测方法，探讨该方对抑郁大鼠海马神经元病理损伤及海马组织GDNF、Spinophilin蛋白表达的影响。

GDNF 来源于神经胶质细胞，是一种在体内广泛表达的多效能神经营养因子，对受损神经元具有修复、保护作用，能促进神经元存活、神经祖细胞分化及突触形成。有研究显示，GDNF 及其受体在海马和前额叶皮质呈高表达，GDNF 基因敲除小鼠表现为海马突触传递功能异常，水迷宫学习能力明显受损。树突棘位于兴奋性突触后膜，其形态、数量变化对突触可塑性有直接影响。Spinophilin 是一种表达于树突棘内的神经支架蛋白，参与树突棘可塑性调节，与树突棘形态、数目及兴奋性突触的传递密切相关，在维持中枢神经系统功能中发挥重要作用。Spinophilin 基因敲除大鼠虽然有完整的感觉信息加工传递过程，但是联想学习能力、厌恶型条件反射学习能力与野生型大鼠相比明显受损，表明Spinophilin 对学习认知过程具有重要影响。本研究显示，与空白组比较，模型组大鼠海马组织树突棘和树突分支数量减少，突触形态损伤，GDNF、Spinophilin蛋白表达显著降低；与模型组比较，复方柴金解郁片各剂量组大鼠海马组织树突棘和树突分支数量增加，突触损伤有所改善，GDNF、Spinophilin蛋白表达显著升高，表明复方柴金解郁片能一定程度上修复海马神经元突触损伤，改善神经元突触可塑性。然而，高剂量组作用较中、低剂量组弱，可能是由于高剂量药物会产生更高浓度的代谢副产物，与药效成分产生竞争性抑制作用，具体机制有待进一步研究。

抑郁症可属中医学“郁证”“百合病”等范畴。复方柴金解郁片以柴胡为君，疏肝解郁；臣以贯叶金丝桃、姜黄，助君药疏肝解郁；佐以紫苏叶、白芍、知母理气解郁、养血柔肝、滋阴除烦。全方共奏疏肝理气、活血解郁之效。

综上，复方柴金解郁片能改善抑郁模型大鼠抑郁症状，修复海马神经元损伤，增加树突棘和树突分支数量，上调海马组织GDNF、Spinophilin蛋白表达，进而调控海马神经元突触可塑性，发挥抗抑郁作用。本研究初步揭示了复方柴金解郁片抗抑郁的作用机制，可为该方的进一步研究奠定基础。