熊果酸通过miR-224/NLRP3轴抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激的RAW264.7细胞M1极化

陈海龙 宗静 宋晓彤

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)是引发牙周炎的主要病原菌，其细胞壁主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通过促使巨噬细胞M1极化来分泌炎性因子，诱导免疫炎症反应，从而造成牙周组织损伤[1-4]。目前消除病原体和重建正常口腔菌群是针对牙周炎治疗的重点，随着治疗过程中抗生素类药物的过度使用及其耐药性的产生，迫切需要寻找抗生素替代药物用以治疗牙周炎[5]。熊果酸已被证明是一种具有抗Pg作用的抗菌化合物，可通过影响细菌膜电位来增加膜通透性，促使膜破裂，以此具有杀菌活性，但是在牙周炎中，熊果酸对巨噬细胞M1极化的影响机制还未阐明[6]。NLRP3作为一种模式识别受体，在宿主防御病原体过程中具有关键作用，研究发现Pg-LPS激活的RAW264.7巨噬细胞中NLRP3表达显著增加，而降低其表达可抑制炎症反应[7-8]。NLRP3是miR-224-5p的靶基因，miR-224-5p通过抑制NLRP3表达降低小胶质细胞炎症激活[9]。因此，本研究对熊果酸是否可通过miR-224/NLRP3轴影响Pg-LPS刺激的RAW264.7细胞M1极化进行了探究，以期为熊果酸在牙周炎中的治疗机制研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 试剂和仪器

小鼠巨噬细胞系RAW264.7(YCL-0190，武汉益普生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(BN17003-0.75 mL，北京百瑞极生物科技有限公司)；BCA蛋白含量检测试剂盒、RPMI-1640培养基、蛋白提取试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(CDLG-5055、CD-02168-ML、CD-13559-ML、CDLG-4997，武汉纯度生物科技有限公司)；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗抗体(A-11001，Invitrogen Antibodies)；兔抗β-actin抗体(ab8227，Abcam，英国)；NLRP3抗体(19771-1-AP，Proteintech);miR-224 mimics、mimic control、pcDNA3.1、miR-224 inhibitor、inhibitor control、pcDNA3.1-NLRP3、实时荧光定量PCR仪(赛默飞世尔，美国)；MTT检测试剂盒(ZY111105-500，上海泽叶生物科技有限公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素10(IL-10)检测试剂盒(CSB-E11987r-1、CSB-E04593h，上海恒斐生物科技有限公司)；白介素1β(IL-1β)检测试剂盒(SEKR-0002，北京索莱宝科技有限公司)；精氨酸酶1(Arginase-1，Arg-1)(EHJ-ZH0063，厦门慧嘉生物科技有限公司)；BioSpectrum-美国UVP凝胶成像系统(上海天放实验仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 RAW264.7细胞接种到DMEM培养基(含100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素+10%胎牛血清)内，并于常规培养箱(37 ℃、5%CO2)中培养至细胞融合到70%～80%时胰酶消化传代。

1.2.2 MTT法检测RAW264.7细胞活力 对数生长期RAW264.7细胞浓度调整为1×105个/mL后以100 μL/孔的量接种到96 孔板中，培养24 h后在每孔中分别添加0、5、10、20、40、80 μmol/L熊果酸(每个浓度设5 个复孔)[10]，再培养48 h后吸出旧培养基，并添加MTT(5 μg/L，20 μL)常规培养4 h，加入二甲基亚砜(150 μL)后在酶标仪490 nm处检测吸光度(A490)值：细胞活力(%)=处理组/对照组×100%。

1.2.3 分组 将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组(1 mg/LPg-LPS)[8]、熊果酸组(40 μmol/L熊果酸)、inhibitor control组(40 μmol/L熊果酸+inhibitor control)、miR-224 inhibitor组(40 μmol/L熊果酸+miR-224 inhibitor)、mimics control组、miR-224 mimics组；取对数生长期RAW264.7细胞，并按照Li-pofectamineTM2000说明书步骤将miR-224 inhibitor、inhibitor control、mimics control及miR-224 mimics分别转至相应组的RAW264.7细胞中，按照分组情况加入40 μmol/L熊果酸及1 mg/LPg-LPS培养48 h。

1.2.4 qRT-PCR检测miR-224表达水平 根据Trizol法提取各组RAW264.7细胞中总RNA后检测RNA浓度及纯度，根据反转录试剂盒步骤将其反转录成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，U6为内参，2-ΔΔCt计算miR-224表达情况(设置5 个重复)，miR-224上游引物5′-CTGGTAGGTAAGTCACTA-3′，下游引物5′-TCAACTGGTGTCGTGGAG-3′；上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.5 ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-10及Arg-1水平 收集各组RAW264.7细胞培养上清液后，按照ELISA检测试剂盒说明书操作，在酶标仪中检测各组细胞吸光度，计算TNF-α、IL-1β、IL-10及Arg-1水平(设置5 个重复)。

1.2.6 流式细胞术检测RAW264.7细胞中CD11c+和CD206蛋白表达情况 将各组RAW264.7细胞悬浮液(1×106个/mL)进行离心、弃上清、PBS重悬(200 μL)，添加PE-CD11c+、FITC-CD206染色30 min后PBS洗涤、多聚甲醛固定(4%)、0.1%皂素(100 μL)破膜10 min，PBS洗涤后重悬，转移至流式管，经流式仪CD11c+和CD206蛋白表达(n=5)。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验检测miR-224和NLRP3的靶向关系 通过TargetScan网址确定miR-224和NLRP3结合位点，NLRP3 3＇-UTR片段经扩增、酶切和连接后进行野生型pmirGLO-NLRP3-wt表达载体的构建，并且经过将结合片段部分核苷酸突变，获得突变型pmirGLO-NLRP3-mut表达载体，将miR-224 mimics、mimic control分别与二者进行转染：pmirGLO-NLRP3-wt+miR-224 mimics组、pmirGLO-NLRP3-wt+mimic control组、pmirGLO-NLRP3-mut+miR-224 mimics组、pmirGLO-NLRP3-mut+mimic control组，培养48 h后吸去培养基后PBS清洗、细胞裂解液(200 μL)裂解细胞，离心后取上清转至新EP管中，按照双荧光素酶试剂盒说明书操作进行染色，海肾荧光值为内参，在酶标仪中分别检测萤火虫及海肾荧光值，最终计算荧光素酶相对活性。

1.2.8 Western blot检测RAW264.7细胞中NLRP3表达 细胞裂解液裂解RAW264.7细胞后提取总蛋白，并使用BCA蛋白试剂盒测定蛋白含量；50 μL上样缓冲液和200 μL蛋白样品混匀、变性(100 ℃)，以30 mg/孔进行SDS-PAGE凝胶电泳后、转膜、脱脂奶粉封闭(1 h)，加入兔抗NLRP3、β-actin(1∶1 000)一抗过夜孵育(4 ℃)，PBS清洗后孵育二抗(2 h)，ECL化学发光试剂显影后于蛋白凝胶成像仪中观察，Image J分析条带灰度值，分析NLRP3蛋白水平(n=5)。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 熊果酸对RAW264.7细胞活力的影响

RAW264.7细胞存活率(100±8.32、88.35±8.04、75.22±10.30、62.91±8.34、51.68±7.13、40.54±6.62)%随熊果酸浓度的增加(0、5、10、20、40和80 μmol/L)而显著降低(P<0.05)，存在剂量依赖性，选取40 μmol/L浓度熊果酸进行后续实验。

2.2 熊果酸对RAW264.7细胞极化的影响

3 组间IL-10、Arg-1、CD206水平差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组相比，LPS组TNF-α、IL-1β、CD11c+水平显著增加(P<0.05)；与LPS组相比，熊果酸组TNF-α、IL-1β、CD11c+水平显著降低(P<0.05)(表1)。

表1 熊果酸对RAW264.7细胞极化的影响(n=5)

2.3 miR-224靶向调控NLRP3的表达

通过TargetScan网址预测，miR-224与NLRP3存在靶向结合位点(图1)；与pmirGLO-NLRP3-wt+mimic control组(0.91±0.16)相比，pmirGLO-NLRP3-wt+miR-224 mimics组荧光素酶活性(0.49±0.11)显著降低(P<0.05)，而两组MUT荧光素酶活性无显著性差异(0.88±0.14vs0.87±0.16，P>0.05)；与对照组(1.21±0.20)相比，mimic control组(1.20±0.23)无显著差异，miR-224 mimics组NLRP3蛋白水平(0.72±0.11)显著降低(P<0.05)(图2)。

图1 miR-224与NLRP3结合位点

图2 miR-224过表达对NLRP3蛋白表达的影响

2.4 miR-224过表达对RAW264.7细胞极化的影响

3 组间IL-10、Arg-1、CD206表达差异无统计学意义(P>0.05)；与LPS组相比，mimic control组TNF-α、IL-1β、CD11c+水平无显著性差异(P>0.05)，miR-224 mimics组TNF-α、IL-1β、CD11c+水平显著降低(P<0.05)(表2)。

表2 miR-224过表达对RAW264.7细胞极化的影响(n=5)

2.5 熊果酸对RAW264.7细胞miR-224及NLRP3表达的影响

与对照组相比，LPS组miR-224表达水平显著降低，NLRP3表达水平显著增加(P<0.05)；与LPS组相比，熊果酸组miR-224表达水平显著增加，NLRP3表达水平显著降低(P<0.05)(表3, 图3)。

表3 熊果酸对RAW264.7细胞miR-224及NLRP3表达的影响(n=5)

图3 熊果酸对NLRP3蛋白表达的影响

2.6 miR-224表达沉默逆转熊果酸对RAW264.7细胞极化的影响

4 组间IL-10、Arg-1、CD206表达差异无统计学意义(P<0.05)；与LPS组相比，熊果酸组TNF-α、IL-1β、CD11c+表达显著降低(P<0.05)；与熊果酸组相比，inhibitor control组TNF-α、IL-1β、CD11c+表达无显著性差异(P>0.05)，miR-224 inhibitor组TNF-α、IL-1β、CD11c+表达显著增加(P<0.05)(表4)。

表4 miR-224表达沉默逆转熊果酸对RAW264.7细胞极化的影响(n=5)

3 讨 论

牙周炎是一种可造成牙齿脱落的慢性炎症性疾病，其特征在于进行性牙槽骨破坏和牙周炎症[11]。牙周炎不仅会导致牙齿脱落，影响患者生活质量，还会增加糖尿病及心血管疾病的发生风险[5]。革兰氏阴性厌氧杆菌Pg是牙周炎的主要致病菌，可释放LPS等致病因子诱导牙周大量IL-1β、TNF-α等促炎因子的分泌，造成炎症损伤[5]。巨噬细胞根据刺激分为两个主要亚群：M1和M2型，LPS可诱导巨噬细胞M1极化，而M1巨噬细胞是促炎因子的主要来源，该细胞的激活会造成牙周炎进程中促炎状态的启动和维持，而M2巨噬细胞可产生IL-10、Arg-1等抗炎因子，促进组织修复[5,12]，因此消除病原体，抑制巨噬细胞M1极化，从而抑制其产生的炎症损伤是牙周炎治疗的关键[5,13]。但由于牙周炎的复发性，造成患者大量使用抗生素类药物，最终产生耐药性，因此寻找有效抗生素替代药物对疾病的治疗极其重要[5]。

熊果酸是一种可从女贞等中草药植物中的抗菌化合物，研究发现，其对牙周病原菌具有有效杀菌作用[14]。蜂胶是一种用于治疗牙周病的传统民间药物，其有效成分熊果酸可通过使Pg膜破裂，而具备杀菌活性[6]。从番石榴叶中所分离的熊果酸能够抑制LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞产生的活性氧及炎症介质，起到抗炎作用[15]。CD11c+是M1型巨噬细胞的特异性标志物，而CD206是M2型巨噬细胞标志物[16-17]。本研究发现，Pg-LPS显著增加RAW 264.7巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、CD11c+蛋白表达，而熊果酸则可显著降低Pg-LPS诱导的TNF-α、IL-1β、CD11c+蛋白水平，而对IL-10、Arg-1、CD206蛋白水平无显著影响。该结果表明，熊果酸能够抑制Pg-LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞M1极化，这可能是熊果酸在牙周炎中的抗炎机制之一。

微小RNA(miRNA)可通过与目标mRNA的互补序列结合来抑制mRNA翻译或致使转录物降解，以此参与牙周炎等炎症性疾病的发生[4]。miR-224高表达可通过下调Ras相关的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)水平来保护牙髓干细胞免受凋亡，从而促进修复缺陷组织[18]。研究发现，miR-224的靶基因NLRP3参与牙周炎的发生，其在牙周炎患者牙龈组织中表达异常增加，并且与IL-1β表达水平正相关[9,19]。NLRP3作为胞内模式识别受体可在识别微生物入侵时被显著激活，有研究发现Pg可诱导RAW 264.7巨噬细胞中NLRP3炎性体激活，而去除Pg则可恢复NLRP3的表达[8,19]。经受力刺激的牙周膜细胞通过激活巨噬细胞中的NLRP3表达来促进M1巨噬细胞极化及IL-1β产生[20]。本研究发现，Pg-LPS显著降低miR-224表达，增加NLRP3蛋白表达，并且发现NLRP3是miR-224的潜在靶基因，这与前人研究结果相似，还发现，miR-224过表达可降低TNF-α、IL-1β、CD11c+蛋白水平，而对IL-10、Arg-1、CD206蛋白水平无显著影响，上述结果表明，miR-224/NLRP3参与Pg-LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞M1极化，促进miR-224表达可抑制RAW 264.7巨噬细胞M1极化，从而抑制炎症反应。本研究还发现熊果酸可增加miR-224表达水平，而降低NLRP3表达，而miR-224表达沉默可逆转熊果酸对TNF-α、IL-1β、CD11c+表达的影响。该结果表明熊果酸对RAW 264.7巨噬细胞M1极化的抑制作用可能与miR-224/NLRP3有关。

综上所述，熊果酸可通过促进miR-224/NLRP3轴来抑制Pg-LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞M1极化。本研究不仅为牙周炎新的有效治疗药物的寻找提供有价值的参考，还为熊果酸在牙周炎中的抗炎机制研究提供依据，但本研究未对miR-224/NLRP3下游机制进行深入探究，这将成为本研究下阶段的研究内容。