氧化锌/银纳米复合物对新型根尖充填材料性能影响的研究

陈耀忠 刘雁军 陈建明 刘根娣

根管治疗失败，无法或难以进行根管再治疗时，根尖手术是保存患牙最重要的治疗方法[1-2]。根尖手术中，根尖充填目的是严密封闭根管末端，防止致病微生物或其产物从根管系统进入根尖周组织，并促进其病变愈合。因此，根尖充填材料(root-end filling material, RFM)的性能是影响根尖手术成功的重要因素之一。

理想的RFM不仅要具有良好的理化性能、封闭性能及生物相容性，还应具备一定的抑菌性能[2-4]。目前，临床上使用的RFM种类众多，性能各异，但大多数材料的抗菌性能并不理想[3-5]。研究表明：在RFM(如MTA)中添加纳米银等抗菌制剂能有效提高其抗菌性能[5]。纳米银虽具有强效、广谱抗菌作用，但也存在极易团聚、不易存放等缺点[6]。氧化锌/银纳米复合物(zinc oxide/silver nanocomposite，ZnO/Ag)是指氧化锌微球表面吸附一定数量的纳米银颗粒，具有抗菌持久、不易团聚等显著优点[7-9]。本课题前期研制的新型根尖充填材料(novel root-end filling material,NRFM)具备良好的理化性能及细胞相容性，但抗菌性能有待提高[10-13]。为此，本文拟通过在NRFM中添加0.5%～2%的ZnO/Ag，制备出新型载氧化锌/银纳米复合物根尖充填材料(novel root-end filling material containing zinc oxide/silver nanocomposite，NRFM-ZnO/Ag)，并对其理化性能、细胞相容性及抗菌性能等进行检测，评价其对NRFM性能的影响。

1 资料与方法

1.1 主要试剂与仪器

自制NRFM粉剂(按质量比，分别取34.8%磷酸四钙、34.8%羟基磷灰石、20%氧化锆、7%聚丙烯酸、1.7%柠檬酸钠及1.7%柠檬酸等材料混合，研磨，过200 目筛)[10]，ZnO/Ag(氧化锌微球的直径为：2～5 μm，图1)由东南大学徐春祥教授惠赠[7-9]。L929细胞(中科院上海细胞研究所)；粪肠球菌ATCC 29212及白色念珠菌ATCC 10231(东南大学附属中大医院检验科)；扫描电子显微镜(SEM，Hitachi公司，日本)；场发射SEM(Carl Zeiss公司，德国)；X-射线衍射仪(X-ray diffraction，XRD，Bruker公司,德国)等。

图1 ZnO/Ag的扫描电镜图片

1.2 方法

1.2.1 NRFM-ZnO/Ag制备 按表1称取不同质量比的NRFM粉剂与ZnO/Ag混合、研磨，制备出4 种粉剂；蒸馏水为液剂。将上述材料按固液相质量比(g/mL)5∶1进行混合、调拌，使其成面团状。

表1 NRFM-ZnO/Ag粉体组成

1.2.2 X射线衍射(XRD)表征 分别将固化1 周的样品材料研磨成粉体，采用XRD对其测试，CuKα辐射，扫描范围(2θ)为20°～50°[11]。

1.2.3 固化时间及压缩强度 采用维卡氏针(直径为1 mm、质量为300 g)法测定样品材料的固化时间；采用万能材料试验机检测固化1周样品材料(Φ 6 mm×4 mm)的压缩强度[12]。

1.2.4 细胞相容性检测 取固化24 h的材料样品(Φ 5 mm×2 mm)高温、高压灭菌30 min后，按ISO 10993-12(2007)标准[13](样品表面积/浸提介质=1.25 cm2/mL)，37 ℃、5%CO2下浸提72 h，制备浸提液。取对数生长期L929细胞接种于96 孔培养板(6×103细胞/孔)，37 ℃、5%CO2培养过夜，弃培养液，添加不同实验材料组浸提液、阴性、阳性对照组(含0.7%丙烯酰胺单体的培养液)各200 μL。常规条件下分别培养24 h，48 h及72 h后，采用MTT比色法测定其细胞相容性。酶标仪(492 nm)测定其吸光度值(A值)，细胞相对增值率(relative growth rate，RGR)计算公式为：RGR(%)=A实验组/A阴性对照组×100%，采用6 级毒性分级法评定细胞相容性[14]。

1.2.5 抗菌实验

1.2.5.1 SEM观察 分别取粪肠球菌ATCC 29212及白色念珠菌ATCC 10231菌株(菌液浓度为1.5×108CFU/mL)，采用Luria-Bertani(LB)液体培养基将细菌稀释至1.5×106CFU/mL，备用。在无菌96 孔板中置入样品材料(Φ 5 mm×1 mm)，每孔加入200 μL悬浮菌液，37 ℃恒温恒湿培养箱中培养1 d，取出样品材料，磷酸缓冲盐溶液润洗，立即放入4%戊二醛液中4 ℃下固定24 h，依次使用30%、50%、70%、80%、90%、95%及100%乙醇梯度脱水，干燥、喷金，SEM观察致病微生物在样品材料表面黏附情况[15]。

1.2.5.2 直接接触法 取消毒样品材料粉体各50 μg置于96 孔板，取50 μL、0.5 个麦氏单位的菌悬液滴加于样品材料粉体表面及空白阴性对照组，使两者充分接触、共培养24 h，添加肉汤培养液450 μL，取样品液体10 μL在培养板上接种，1 d后计算其回收菌落数。抗菌率计算公式为：r(%)=(b-c)÷b×100%；r为抗菌率(%)；b为阴性对照组平均回收菌落数；c为实验各组的平均回收菌落数[16]。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 XRD表征

图2显示：与NRFM一致，载0.5%～2%ZnO/Ag的样品材料主要出现羟基磷灰石(hydroxyapatite，H)、磷酸四钙(tetracalcium phosphate,T)及氧化锆(zirconium dioxide,Z)的特征峰；但NRFM-2%ZnO/Ag的磷酸四钙特征峰较其他材料组显著增强。

图2 NRFM及NRFM-ZnO/Ag的XRD表征

2.2 固化时间及压缩强度

表2显示NRFM与NRFM-ZnO/Ag的固化时间介于11.6～14.1 min，各组材料间差异无统计学意义(P>0.05)；压缩强度介于39.7～57.8 MPa，而NRFM-2%ZnO/Ag的压缩强度(39.7±8.9)MPa显著低于NRFM组(P<0.05)。

表2 NRFM-ZnO/Ag固化时间及压缩强度

2.3 细胞相容性

48 h及72 h组NRFM-2%ZnO/Ag浸提液的RGR显著低于阴性对照组(P<0.05)，其余各实验组与阴性对照组差别无显著性意义(P>0.05)，细胞毒性为0～Ⅰ级；阳性对照组RGR均显著低于阴性对照组(P<0.01)，细胞毒性为Ⅲ～Ⅳ级(表3)。

表3 MTT比色法检测NRFM-ZnO/Ag的RGR及毒性级别

2.4 抗菌性能

2.4.1 SEM观察 图3显示在NRFM-1.5%ZnO/Ag及NRFM-2%ZnO/Ag样品材料表面黏附的粪肠球菌显著少于其他组。载1%～2% ZnO/Ag的3 组NRFM样品材料表面黏附的白色念珠菌也显著少于其他组(图4)。

图3 粪肠球菌在NRFM-ZnO/Ag材料表面生长(SEM，×5 000)

图4 白色念珠菌在NRFM-ZnO/Ag材料表面生长(SEM，×2 500)

2.4.2 直接接触法 表4及图5可见NRFM及NRFM-0.5%ZnO/Ag的抑制粪肠球菌的性能与阴性对照组相似(P>0.05)，显著小于载1%～2%ZnO/Ag的NRFM样品材料(P<0.05)。NRFM及NRFM-ZnO/Ag对白色念珠菌均有一定抑制作用(P<0.05)，其中2%NRFM-ZnO/Ag抗菌作用最强(P<0.05，表4及图6)。

表4 NRFM-ZnO/Ag的抗菌率

图5 NRFM-ZnO/Ag抗菌性能测定的粪肠球菌菌落生长情况

图6 NRFM-ZnO/Ag抗菌性能测定的白色念珠菌菌落生长情况

3 讨 论

根管充填后，残留在根管系统内或根尖周组织的致病微生物感染是导致根管治疗失败的主要原因。鉴于粪肠球菌及白色念珠菌可能是造成根管治疗失败的主要致病微生物[17-19]，本文将其作为NRFM-ZnO/Ag抗菌作用的受试致病微生物。

NRFM不含抗菌成分，对粪肠球菌无明显抑制作用，这与本研究结果相一致[10]。为此，本文首次在NRFM粉剂内添加0.5%～2%的ZnO/Ag，并评价其对NRFM性能的影响。SEM检测结果显示NRFM-1.5%ZnO/Ag及NRFM-2%ZnO/Ag表面黏附的粪肠球菌及白色念珠菌数量明显少于NRFM组，且生长状态差，说明该材料不利于这两种微生物的黏附及其生物膜的形成。直接接触实验进一步验证了这两种材料的抗菌作用。因此，在NRFM内添加0.5%～2%的ZnO/Ag能改善其抗菌性能，且与剂量相关。梁蓓蕾等[16]研究显示在复合树脂添加抗菌剂(纳米氧化锌)能改善其抑制变形链球菌生长的能力，并与剂量相关，这与本研究结果相一致。

在NRFM内添加ZnO/Ag能有效提高其抗菌性能，但对其理化性能的影响未知。XRD表征显示在NRFM内添加0.5%～1.5%的ZnO/Ag的谱图与NRFM与相似，说明在NRFM中添加少量的ZnO/Ag不会显著影响其水化固化反应及其主要反应产物的生成；但NRFM-2%ZnO/Ag谱图中磷酸四钙特征峰明显增强，提示2%ZnO/Ag可能影响磷酸四钙水化固化反应生成羟基磷灰石[11-13]。另外，在XRD谱图中并未出现氧化锌及银的特征峰，这可能与检测材料中ZnO/Ag含量较低相关。材料的压缩强度结果显示仅NRFM-2%ZnO/Ag的压缩强度(39.7±8.9)MPa显著小于NRFM组(54.7±6.9)MPa(P<0.05)，说明随着ZnO/Ag剂量的增加，可能会导致其压缩强度降低。

ZnO/Ag是利用氧化锌微球比表面积大且稳定的特性为银的附着提供良好的载体[7-9]，但释出的Ag+可在细胞内累积，产生一定的细胞毒性，因此必须探讨NRFM-ZnO/Ag的细胞相容性[20]。本文结果显示载0.5%～1.5%ZnO/Ag的NRFM的RGR介于89.77%～94.98%，细胞毒性为Ⅰ级，符合GB/T16886.5-2003标准[11]，且与阴性对照组差别无统计学意义(P>0.05)，说明其具有较好的细胞相容性。但48 h及72 h组的NRFM-2%ZnO/Ag的RGR显著小于阴性对照组，说明其细胞毒性随着ZnO/Ag含量增加而增强。

综上，在NRFM中添加ZnO/Ag能改善其抗菌性能，并对其理化性能及细胞相容性产生一定影响。NRFM-1.5%ZnO/Ag理化性能、细胞相容性及抗菌性能均俱佳，临床应用前景良好，但该材料的分子生物相容性及抗菌机制还有待于进一步探讨。