蛋白酶辅助孵育对薏米麸皮抗氧化活性的影响

高 珊， 闫璟圆， 张 倩， 梁乃国， 陈晓明， 徐 磊

(淮阴工学院生命科学与食品工程学院，淮安 223003)

薏米又名“菩提子、胶念珠”等，含有丰富的蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质和维生素以及多糖、酚类和三萜类等活性成分，据统计我国年消耗薏米超过1×109kg[1]。薏米是一种加工价值极高的药食两用资源，具有多种生理和药理活性[2]。薏米麸皮是薏米加工精白过程中的主要副产物，约占薏米籽粒质量的25%[3]，研究表明薏米麸皮较薏米籽粒其他部位具有更高的多酚含量[4]，目前主要用作薏米油提取、饲料或者直接丢弃，利用程度较低。

麸皮作为谷物加工的重要副产物，具有较高的营养和生理价值，但其致密结构在一定程度上限制了其功能活性的发挥[5]。物理、生物等手段可用于麸皮结构改善和功能性成分富集[6, 7]。孵育处理主要通过调节植物体的水分含量和温度的方式激活内源酶发挥作用，目前已被应用于多种谷物及其副产物功能活性的改善，具有操作简便、成本低等优点，适用于大规模生产。Guo等[8]研究发现通过激活麦麸内源植酸酶可以显著降低其抗营养因子植酸盐含量。Oh等[9]研究发现厌氧孵育可激活谷氨酸脱羧酶，提高大米麸皮中γ-氨基丁酸的含量。Yang等[10]利用孵育处理小麦胚芽，显著提高了其血管紧张素转化酶抑制率和多肽含量。此外，孵育处理可显著提高小麦麸皮的多酚、γ-氨基丁酸含量及其抗氧化活性，摄食孵育小麦麸皮可更好的改善小鼠高脂饮食诱导的胰岛素抵抗[11]。脱脂薏米麸皮中含有大量的内源酶，孵育处理可显著改善其营养组成和抗氧化活性[12]。但单独孵育处理时仍存在植物体内源酶活力低、专一性差等问题，Arte等[7]研究发现碳水化合物酶辅助孵育可促进小麦麸皮孵育过程中的蛋白质降解，然而目前国内外关于蛋白酶辅助孵育处理麸皮的研究鲜有报道。

本研究以脱脂薏米麸皮为原料，在麸皮孵育过程中分别添加酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，考察蛋白酶辅助孵育对脱脂薏米麸皮微观结构、蛋白分子质量分布、总酚、总黄酮、酚酸组成及抗氧化活性的影响，以期阐明蛋白酶辅助孵育对脱脂薏米麸皮抗氧化活性的影响规律，为薏米加工副产物的开发利用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

薏米麸皮于2020年4月采购，麸皮经正己烷脱脂，粉碎过筛后4 ℃保存备用。

酸性蛋白酶(10.0×104U/g)、木瓜蛋白酶(10.0×104U/g)、中性蛋白酶(9.5×104U/g)、碱性蛋白酶(9.7×104U/g)；6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)，分析纯。

1.2 仪器与设备

RXZ-300A人工气候箱，TGL20M冷冻离心机，SCIENTZ-10N冷冻干燥机，SU8010扫描电子显微镜(SEM)，LC-2030液相色谱仪。

1.3 方法

1.3.1 脱脂薏米麸皮孵育处理

准确称取30 g脱脂薏米麸皮于100 mL烧杯中，按料液比1∶1.5(g/mL)加入去离子水，按1 000 U/g加酶量分别添加酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，充分搅匀，50 ℃水浴锅中孵育12 h。单独孵育时不添加任何蛋白酶。孵育结束后样品立即进行冷冻干燥，粉碎过筛，于4 ℃储存备用。

1.3.2 微观结构表征

将冷冻干燥好的麸皮粉末样品用双面胶固定于样品台上，进行离子溅射喷金(10 nm)处理，然后将制备好的样品置于SEM样品室中，设置加速电压为10 kV，放大1 000倍观察麸皮样品微观结构。

1.3.3 蛋白分子质量分布测定

参考Zhao等[13]的方法采用分子排阻色谱进行蛋白分子质量分布分析，准确称取0.1 g麸皮样品，按料液比1∶40(g/mL)加入0.05 mol/L磷酸钠缓冲溶液(pH 6.8，含2% SDS)，室温旋转提取12 h，离心(10 000 g)15 min，上清液过0.45 μm滤膜后进行HPLC分析。HPLC系统使用TSK gel G2000 SWXL凝胶柱(300 mm×7.8 mm)；流动相为含0.2% SDS的磷酸钠缓冲溶液(0.05 mol/L，pH 6.8)；柱温和流速分别为30 ℃和0.7 mL/min；进样体积和检测器波长分别为20 μL和214 nm。

1.3.4 游离氨基酸组成测定

参考Zang等[14]的方法进行游离氨基酸组成分析，准确称取1 g麸皮样品，用5%三氯乙酸定容到25 mL，超声提取30 min，然后10 000 g离心15 min，取上清液过0.45 μm的微孔滤膜后上氨基酸自动分析仪进行游离氨基酸组成测定，结果以每1 g麸皮样品(干基)中氨基酸含量计。

1.3.5 总酚、总黄酮含量测定

参照Min等[15]提取脱脂麸皮中的游离、结合型酚类物质，用80%甲醇定容，-40 ℃储存待用。

采用福林酚法进行总酚含量测定[16]，取50 μL酚类物质提取液，加入3.95 mL去离子水和0.25 mL福林酚试剂混匀，静置6 min后加入0.75 mL 20% Na2CO3溶液和2.5 mL去离子水，混匀。40 ℃恒温水浴避光反应2 h，于760 nm波长处测定其吸光值，总酚含量以每100 g麸皮样品(干基)中没食子酸当量计(mg GAE/100g DW)。

总黄酮含量的测定参照Amir等[17]的方法，并略做修改，取0.5 mL稀释1倍的酚类物质提取液，2 mL 30%乙醇溶液和150 μL 5% NaNO2溶液，振荡混匀，6 min后加入150 μL 10% Al(NO3)3·9H2O溶液，混匀静置6 min，再依次加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.2 mL去离子水，混匀。置于黑暗处反应15 min，于510 nm波长处测定吸光值，总黄酮含量以每100 g麸皮样品(干基)中芦丁当量计(mg RE/100 g DW)。

1.3.6 酚类物质组成测定

参考Chen等[18]的方法对麸皮样品中的酚类物质进行定性和定量分析，色谱条件如下：SunFire C18色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相A为含有0.1%乙酸的去离子水，流动相B为含有0.1%乙酸的甲醇；柱温、检测波长、流速和进样量分别为35 ℃、280 nm、0.9 mL/min和20 μL。

1.3.7 抗氧化活性测定

参照Benzie等[19]的方法测定铁离子还原能力(FRAP)，取45 μL样液于离心管中，依次加入675 μL去离子水和5.4 mL 新鲜配制的FRAP试剂，混匀。室温避光反应30 min，于593 nm波长处测定吸光值，FRAP以每1 g麸皮样品(干基)中Trolox当量计(μmol TE/g DW)。参照Erel等[20]的方法进行ABTS+·清除能力测定，将100 μL稀释1倍的酚类物质提取液与3.9 mL 新鲜配制的ABTS工作液混合，室温避光反应15 min，于734 nm 波长处测定吸光度值，ABTS+·清除能力以每1 g麸皮样品(干基)中Trolox当量计(μmol TE/g DW)。

1.4 数据统计与分析

所有实验均重复测定3次，用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析(P<0.05表示差异显著)，用Pearson双侧检验法进行相关性分析，用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶辅助孵育对脱脂薏米麸皮微观形貌的影响

如图1所示，未孵育的脱脂薏米麸皮结构紧密，淀粉颗粒镶嵌在蛋白质网络中，经单独孵育处理后，紧密结构变得松散，蛋白质体开始消失，被包裹的淀粉颗粒逐渐暴露出来。添加蛋白酶辅助孵育后，大的蛋白质体已基本看不到，淀粉颗粒表面蛋白消失，变得更为光滑，其中中性和碱性蛋白酶组最为明显。麸皮中主要含有纤维、蛋白质和淀粉等物质，麸皮孵育过程中激活的多种内源酶和外源蛋白酶都可降解这些物质，进而改善麸皮的微观形貌[8]。

2.2 蛋白酶辅助孵育对脱脂薏米麸皮蛋白分子质量分布的影响

由图2可见，未孵育时脱脂薏米麸皮蛋白主要集中在F2区域(分子质量为20.0～97.4 ku)，单独孵育后位于F2区域的峰2和峰3面积显著降低，而位于F3区域(分子质量低于20.0 ku)的峰4～峰6面积升高，与研究报道孵育处理可以降解小麦麸皮蛋白生成多肽和氨基酸的结果一致[7]。添加蛋白酶后，峰2和峰3面积进一步降低，而峰4～峰6的面积进一步升高，其中碱性蛋白酶组峰2和3已基本消失，表明麸皮在孵育过程中高分子质量蛋白发生降解，生成大量小分子多肽和氨基酸，外源蛋白酶的加入可进一步促进高分子质量蛋白的降解。位于F1区域(分子质量高于97.4 ku)的蛋白在蛋白酶辅助孵育处理过程中变化较小。中性和碱性蛋白酶辅助孵育过程中降解脱脂薏米麸皮蛋白质的能力显著高于其他蛋白酶，不同蛋白酶酶解特性的差异导致了麸皮蛋白分子质量在辅助孵育过程中变化的不同[21]。多酚和黄酮类物质可以共价键的形式结合于蛋白等大分子，脱脂薏米麸皮蛋白酶辅助孵育过程中蛋白的显著降解可在一定程度上促进麸皮中结合态多酚和黄酮的释放，提高其抗氧化活性[22]。

图1 蛋白酶辅助孵育后脱脂薏米麸皮微观形貌的变化(×1 000)

图2 蛋白酶辅助孵育后脱脂薏米麸皮蛋白分子质量分布的变化

2.3 蛋白酶辅助孵育对脱脂薏米麸皮游离氨基酸的影响

如图3所示，脱脂薏米麸皮经孵育处理后总游离氨基酸含量显著增加(P<0.05)，单独孵育时较未孵育时增加了5.41倍，这与Oh等[9]和Sang等[11]的研究结果是一致的。相较于单独孵育，添加蛋白酶辅助孵育处理后总游离氨基酸含量增加了45.33%～120.01%(P<0.05)，中性蛋白酶和碱性蛋白酶对于总游离氨基酸的提高显著高于其他蛋白酶(P<0.05)，这与脱脂薏米麸皮孵育过程中蛋白分子质量分布的变化是一致的。未孵育时，精氨酸、谷氨酸和丙氨酸是脱脂薏米麸皮中的主要游离氨基酸，单独孵育处理后各氨基酸含量均显著增加(P<0.05)。蛋白酶辅助孵育后各游离氨基酸含量进一步增加，其中亮氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸的增加量最多，而天冬氨酸、甘氨酸的增加量最少。脱脂薏米麸皮蛋白酶辅助孵育过程中内、外源蛋白酶的共同作用可以促进麸皮蛋白质的充分降解，从而生成更多的游离氨基酸[21]。

注：同一指标不同字母表示数据之间存在显著差异(P<0.05)，下同。图3 蛋白酶辅助孵育后脱脂薏米麸皮氨基酸含量的变化

2.4 蛋白酶辅助孵育对脱脂薏米麸皮总酚和总黄酮含量的影响

多酚、黄酮类化合物是植物体中重要的次生代谢产物，可以游离型和结合型的形式存在，具有多种生理和药理活性[23]。由图4可见，脱脂薏米麸皮经单独孵育处理后，游离型、结合型和总多酚、黄酮含量显著增加(P<0.05)。相较于单独孵育，添加蛋白酶孵育后游离型多酚含量提高了3.93%～19.21%，结合型多酚含量未发生显著变化(P>0.05)，总多酚含量提高了2.61%～11.51%；游离型黄酮含量提高了21.89%～39.00%，结合型黄酮含量未发生显著变化(P>0.05)，总黄酮含量提高了12.30%～21.68%；中性蛋白酶对于游离型和总多酚、黄酮含量的提高显著高于其他蛋白酶(P<0.05)，而酸性蛋白酶的效果最差(P>0.05)。脱脂薏米麸皮孵育过程中蛋白酶、纤维素酶等内源酶被激活，可水解植物细胞壁促进结合态多酚和黄酮类物质释放。与本研究结果类似，Shang等[11]在小麦麸皮孵育过程中也报道了显著提高的游离多酚含量。外源酶制剂的加入可进一步促进麸皮中大分子物质的降解，提高游离型多酚和黄酮的含量[7]。

图4 蛋白酶辅助孵育后脱脂薏米麸皮总酚和总黄酮含量的变化

2.5 蛋白酶辅助孵育对脱脂薏米麸皮酚酸组成的影响

如表1所示，脱脂薏米麸皮共检出6种游离型和5种结合型酚酸。蛋白酶辅助孵育处理后酚酸种类未发生改变，但其含量发生显著变化。麸皮样品中原儿茶酸和咖啡酸仅以游离型的形式存在，单独孵育后含量显著增加(P<0.05)，蛋白酶辅助处理后进一步提高(P<0.05)。单独孵育后，游离型、结合型和总香草酸含量显著增加(P<0.05)，相较于单独孵育，蛋白酶辅助处理后除木瓜蛋白酶组外游离型和总香草酸含量均显著增加(P<0.05)，而结合型含量未发生显著变化(P>0.05)。香豆酸主要以结合型的形式存在，单独孵育后其游离型、结合型和总量显著增加(P<0.05)，相较于单独孵育，蛋白酶辅助处理后游离型香豆酸含量提高了2.60%～13.36%，而结合型和总量未发生显著变化(P>0.05)。阿魏酸也主要以结合型的形式存在，单独孵育后其游离型、结合型和总量显著增加(P<0.05)，蛋白酶辅助处理后游离型、结合型和总阿魏酸含量进一步增加。芥子酸以游离型和结合型的形式存在，相较于单独孵育，蛋白酶辅助处理后游离型芥子酸含量均显著增加(P<0.05)，但不同蛋白酶组间无显著差异(P>0.05)，而结合型含量未发生显著变化(P>0.05)。丁香酸仅以游离型的形式存在，单独孵育后增加了158.33%，而蛋白酶辅助处理后含量未发生显著变化(P>0.05)。蛋白酶辅助孵育过程中由于麸皮内源酶和外加蛋白酶的共同作用可释放脱脂薏米麸皮内以结合状态存在的酚酸，改变麸皮的酚酸组成[24]。

表1 蛋白酶辅助孵育后脱脂薏米麸皮酚酸组成的变化/μg/g DW

2.6 蛋白酶辅助孵育对脱脂薏米麸皮抗氧化活性的影响

由图5可见，脱脂薏米麸皮经单独孵育处理后，游离型、结合型和总FRAP分别增加了40.08%、13.02%和29.39%，而游离型、结合型和总ABTS+·清除能力分别增加了13.32%、5.31%和9.34%。相较于单独孵育，添加蛋白酶孵育后游离型FRAP提高了1.68%～14.61%，结合型FRAP未发生显著变化(P>0.05)，总FRAP提高了1.47%～9.18%；游离型ABTS+·清除能力提高了1.51%～8.93%，结合型ABTS+·清除能力未发生显著变化(P>0.05)，总ABTS+·清除能力提高了0.54%～3.75%；中性蛋白酶对于游离型和总FRAP和ABTS+·清除能力的提高显著高于其他蛋白酶(P<0.05)，而酸性蛋白酶的效果最差(P>0.05)。研究表明多酚、黄酮类化合物具有较高的抗氧化活性[25]，脱脂薏米麸皮蛋白酶辅助孵育过程中显著提高的总酚和总黄酮含量都可能在一定程度上促进了其抗氧化活性的提高。与本研究结果类似，孵育处理被报道可显著提高小麦麸皮的抗氧化活性[11]。

图5 蛋白酶辅助孵育后脱脂薏米麸皮FRAP和ABTS+·清除能力的变化

2.7 脱脂薏米麸皮总酚、总黄酮含量和抗氧化活性的相关性分析

为进一步明确脱脂薏米麸皮总酚、总黄酮含量与FRAP、ABTS+·清除能力之间的关系，对不同蛋白酶辅助孵育处理后的数据进行相关性分析，结果见表2。总酚含量与FRAP和ABTS+·清除能力均呈极显著正相关(P<0.01)，总黄酮含量与FRAP和ABTS+·清除能力也均呈极显著正相关(P<0.01)，说明脱脂薏米麸皮总酚、总黄酮含量越高，其FRAP和ABTS+·清除能力越强，表明酚类、黄酮类物质是脱脂薏米麸皮中发挥抗氧化活性的主要贡献物质[26]。此外，脱脂薏米麸皮的FRAP和ABTS+·清除能力之间存在极显著正相关(P<0.01)，这与Thaipong等[27]报道的番石榴提取物不同抗氧化活性测定方法之间存在显著相关性的结果类似。

表2 脱脂薏米麸皮总酚、总黄酮含量与抗氧化活性相关性分析

3 结论

蛋白酶辅助孵育后脱脂薏米麸皮微观结构发生明显变化，蛋白质体消失，淀粉颗粒表面变得更加光滑。薏米麸皮蛋白在辅助孵育后发生更大程度的降解，游离氨基酸含量显著增加(P<0.05)。与单独孵育时相比，蛋白酶辅助孵育可显著提高游离型多酚、黄酮含量(P<0.05)，而对结合型多酚、黄酮含量无显著影响(P>0.05)。薏米麸皮中共检出6种游离型酚酸和5种结合型酚酸，相较单独孵育，蛋白酶辅助孵育后游离型酚酸含量显著增加(P<0.05)，同时游离型FRAP和ABTS+·清除能力显著增强(P<0.05)。此外，相关性实验表明酚类、黄酮类物质是脱脂薏米麸皮中发挥抗氧化活性的主要贡献物质。中性蛋白酶相较于其他蛋白酶具有更好的辅助孵育提高抗氧活性的作用。