贺 晶,李 艳,王延峰,鲍 慧
(延安大学附属医院 1.妇科; 2.检验科; 3.肿瘤科,陕西 延安 716000)
子宫内膜癌(endometrial cancer)是常见的女性生殖系统肿瘤,发病率有逐年上升的趋势,5年生存率不足30%。因此,研究子宫内膜癌的发病机制,对于提高治疗效果具有重要意义[1-2]。脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)是脂肪代谢的重要调节因子,可参与调控基因表达和肿瘤相关的信号传导,与肿瘤发生发展密切相关[3]。FABP4在乳腺癌和肺癌等多种肿瘤中表达上调,参与肿瘤细胞的增殖和分化等病理学过程[4-5]。然而,FABP4在子宫内膜癌中的表达及其作用尚不清楚。本研究拟分析FABP4在子宫内膜癌组织中的表达,以探讨其与子宫内膜癌临床病理特征的关系;通过干扰FABP4表达以探讨FABP4对子宫内膜癌细胞系HEC-1-A增殖、迁移和侵袭的影响,以期为子宫内膜癌发病机制及治疗提供理论基础。
1.1.1 细胞系:人子宫内膜癌细胞系HEC-1-A(中国科学院细胞库)
1.1.2 试剂及试剂盒:si-FABP4和si-NC(广州市锐博生物科技有限公司设计合成);噻唑蓝(MTT)试剂盒和ECL发光液(ThermoFisher Scientific公司);胎牛血清和RPMI 1640培养基(Gbico公司);FABP4和β-actin引物序列(上海生工生物工程有限公司设计合成);HiperFect Transfection Reagent(Qiagen公司);兔抗人FABP4、MMP-2和MMP-9单克隆抗体(Abcam公司)。
1.2.1 子宫内膜癌组织的获取:选取2017年3月至2021年3月在延安大学附属医院进行治疗的71例子宫内膜癌患者为研究对象,所有患者均经病理学诊断为子宫内膜癌,且在术前未经任何放射治疗与化学治疗,手术过程中取癌组织及癌旁组织,并于-80 ℃冰箱保存,该研究得到本院伦理委员会的批准(批号:201702-21)以及家属的知情同意。
1.2.2 细胞的分组及转染:将EC-1-A细胞分为对照组、FABP4阴性对照(si-NC)组和干扰FABP4(si-FABP4)组。HEC-1-A细胞汇合至70%左右时,分别转染干扰FABP4表达质粒(si-FABP4)及阴性对照质粒(si-NC),对照组不做转染处理,转染4 h后更换新鲜RPMI 1640培养液培养24 h,进行后续实验。
1.2.3 RT-qPCR检测FABP4水平:用RT-qPCR检测子宫内膜癌组织及各组细胞中FABP4 mRNA相对表达量,Trizol试剂提取总RNA,用反转录试剂盒合成cDNA后,进行RT-qPCR扩增。FABP4上游引物序列(5′-3′):CGGAATTCATGTGTGATGCTTTTG TAGGTACC;下游引物序列(5′-3′):ATAAGAATGC GGCCGCTTATGCTCTCTCATAAACTCTCGTG。β-actin上游引物序列(5′-3′):CAAGGTCATCCATGACAA CTTTG;下游引物序列(5′-3′):GTCCACCACCTGTT GCTGTAG。以β-actin为内参,采用2-△△Ct法计算FABP4 mRNA相对表达量。
1.2.4 MTT法检测细胞增殖:用MTT法检测转染后HEC-1-A细胞增殖。将转染后HEC-1-A培养48 h后,每孔加入10 μL的MTT液(浓度5 g/L)继续培养4 h,再加入150 μL的DMSO溶液,振荡溶解,在酶标仪490 nm处检测吸光度(A)值。
1.2.5 细胞平板集落实验检测各组HEC-1-A细胞的集落形成能力:取转染后对数增殖期的各组HEC-1-A细胞接种于6孔板中,每隔3 d观察细胞形态,至肉眼可见单个集落形成时终止培养,多聚甲醛固定30 min,结晶紫染色10 min,观察并拍照,计算集落形成率。
1.2.6 Transwell小室法检测细胞迁移与侵袭:迁移:取各组转染HEC-1-A细胞,用无血清培养液将细胞制成细胞悬液,接种于Transwell上室中,下室加入500 μL含10%胎牛血清的培养液,继续培养24 h,多聚甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色15 min。随机选择5个视野于显微镜下观察迁移细胞数。侵袭:无血清培养基稀释融化的Matrigel,加60 μL于Transwell上室,待基质胶凝固,Transwell上室加入200 μL无血清稀释的各组细胞悬液,其余步骤同上。随机选择5个视野于显微镜下观察侵袭细胞数。
1.2.7 免疫印迹法(Western blot)检测FABP4、MMP-2和MMP-9蛋白表达:提取各组细胞总蛋白并检测蛋白浓度,每组取10 μg蛋白经SDS-PAGE后,经转膜封闭后,分别加入抗FABP4、MMP-2、MMP-9或β-actin单克隆抗体,室温孵育2 h,PBST洗涤再加二抗稀释液孵育1 h,再加ECL发光液显色,以β-actin为内参,分析条带灰度值结果。
子宫内膜癌组织中FABP4表达为(2.58±0.26)显著高于癌旁(1.05±0.13)(P<0.05)。
根据子宫内膜癌组织中FABP4表达水平,将子宫内膜癌患者分为FABP4高表达(≥2.58)35例和FABP4低表达(<2.58)36例,分析发现FABP4表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05),而与患者年龄、肿瘤直径、肌层浸润和分化程度无关(表1)。
表1 FABP4 mRNA表达与子宫内膜癌临床病理 特征的关系
与对照组和si-NC组相比,si-FABP4组HEC-1-A细胞FABP4及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)(图1)。
*P<0.005 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group图1 各组细胞FABP4蛋白表达Fig 1 FABP4 protein expression in each group of cells
与对照组和si-NC组相比,si-FABP4组HEC-1-A细胞吸光度(A)值显著降低(P<0.05)(图2)。
*P<0.005 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group图2 转染si-FABP4后HEC-1-A细胞增殖Fig 2 Proliferation of HEC-1-A cells after transfec- tion of si-FABP4(x±s,n=6)
与对照组和si-NC组相比,si-FABP4组HEC-1-A细胞集落形成率显著降低(P<0.05)(图3)。
*P<0.005 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group图3 各组HEC-1-A细胞集落形成Fig 3 Formation of HEC-1-A cell colonies in each
与对照组和si-NC组相比,si-FABP4组HEC-1-A细胞迁移数与侵袭数显著降低(P<0.05)(图4)。
*P<0.05 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group图4 各组HEC-1-A细胞迁移侵袭Fig 4 Migration and invasion of HEC-1-A cells in each
与对照组和si-NC组相比,si-FABP4组HEC-1-A细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达量显著降低(P<0.05)(图5)。
*P<0.05 compared with control group; #P<0.005 compared with si-NC group图5 各组HEC-1-A细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达Fig 5 Protein expression of MMP-2 and MMP-9 in HEC-1-A cells in each
子宫内膜癌是三大常见妇科恶性肿瘤,由于早期症状不明显,多数患者确诊时已进展到晚期。该肿瘤恶性程度高、病死率高、预后差。肿瘤复发、侵袭和转移是影响患者预后重要因素。因此,研究子宫内膜癌侵袭与转移的机制,对于提高子宫内膜癌的疗效及改善预后有重要意义[6-7]。
多项报道显示,FABP4与乳腺癌及肝癌等肿瘤相关疾病有关[8-9]。有研究表明[10],结肠癌患者肿瘤组织中FABP4表达水平升高,且是结肠癌发生发展的独立风险因素。还有研究表明[11],乳腺癌组织中FABP4表达水平显著增加,且与乳腺癌转移有关;敲低或过表达FABP4后,可抑制或促进乳腺癌细胞侵袭。本研究结果显示,子宫内膜癌组织中FABP4表达水平显著高于癌旁组织。提示,FABP4表达与子宫内膜癌发生有关。通过分析FABP4与子宫内膜癌临床病理特征相关性,发现FABP4表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关。提示,FABP4可能参与子宫内膜癌的发生发展。
FABP4在多种癌细胞中表达上调,可显著促进肿瘤细胞的侵袭与迁移,而抑制FABP4表达,可显著抑制细胞转移能力[12]。本研究发现,干扰FABP4表达水平可显著降低HEC-1-A细胞增殖、迁移和侵袭行为,与前人研究结果类似,提示,FABP4在子宫内膜癌迁移与侵袭过程中发挥重要作用。然而,其具体作用机制尚不清楚。研究表明,肿瘤细胞外基质的降解及基底膜破坏是肿瘤细胞发生侵袭和转移的重要原因。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可降解细胞外基质,其中MMP-2和MMP-9是重要的MMPs,在增强肿瘤细胞侵袭中发挥重要作用[13]。本研究干扰FABP4表达后,HEC-1-A细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达量显著降低。提示,干扰FABP4表达可影响HEC-1-A细胞迁移侵袭相关蛋白表达。由此推测,子宫内膜癌中FABP4表达上调可促进子宫内膜癌细胞的侵袭及转移。
综上所述,FABP4在子宫内膜癌组织中高表达,且与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关,干扰FABP4表达可抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭,但其具体作用机制尚不完全清楚,仍需作进一步研究。