慢性肾衰竭对大鼠肠黏膜屏障及自噬相关蛋白表达的影响

张紫媛，方敬爱，李苏芬，胡雅玲，张晓东，刘文媛，刘学军

(山西医科大学第一医院 1.肾内科； 2.妇科； 3.老年科， 山西 太原 030001；4.山西医科大学， 山西 太原 030001)

慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)是指各种慢性肾脏病引起的肾小球滤过率下降及与此相关的代谢紊乱和临床症状组成的综合征，已经成为严重威胁人类健康的公共问题。

有研究表明，CRF时肠道紧密连接蛋白表达下降，肠道菌群紊乱，细菌移位率升高，提示存在肠道屏障损伤[1]，其机制可能与微炎性反应状态和氧化应激有关[2]。自噬是在自噬相关基因和蛋白的调控下，利用溶酶体降解细胞内物质成分的过程，对维持细胞内环境稳态等方面起着重要作用。近年的研究发现，自噬可通过多种方式调控肠黏膜屏障损伤[3-4]，但在CRF肠道屏障损伤中的作用机制目前尚未有研究。因此，本研究拟在此方面进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF雄性SD大鼠30只，体质量(200±20)g[山西医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(晋)2015-0001]。

1.1.2 试剂：兔抗Beclin-1抗体(Cell Signaling Technology 公司)；兔抗LC3、claudin-1抗体(Abcam公司)；兔抗ZO-1抗体(Proteintech Group公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Immunoway公司)；肌酐、尿素氮试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-α、内毒素试剂盒(武汉博士德生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及模型的建立:大鼠实验全程均给予普通饲料喂养，自由进水。适应性饲养1周后，随机分为假手术组10只和模型组20只，行左肾切除术，经1周恢复后，灌胃给予腺嘌呤200 mg/(kg·d)4周。随后观察实验动物行为活动、体质量等一般状态。于造模后4和8周留取各组大鼠血清、肾脏及结肠组织标本。

1.2.2 ELISA检测肾功能及炎性因子:用ELISA检测各组血清肌酐、尿素氮、TNF-α、IL-6、LPS。

1.2.3 HE染色观察肾脏及结肠组织病理改变:留取肾脏及结肠组织，浸泡于4%多聚甲醛中固定，双蒸水清洗。梯度乙醇脱水，二甲苯溶液透明，石蜡包埋、切片。HE染色，光镜下观察肾脏及结肠组织病理改变。

1.2.4 Western blot检测LC3、beclin-1、ZO-1、claudin-1蛋白表达:提取结肠组织总蛋白，测定蛋白浓度，上样后电泳分离蛋白质。将凝胶中的蛋白质移至PVDF膜上，于5%脱脂牛奶封闭液中室温封闭1 h。加入5%脱脂牛奶稀释的一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，次日 TBS-T 洗膜3次，每次5 min。辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶500)室温孵育1 h，TBS-T洗膜3次，每次5 min，加入ECL化学发光试剂，成像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

模型组左肾切除术后伤口无出血，术后5 d死亡1只，考虑与感染有关，其余大鼠均无异常。给予腺嘌呤灌胃4周后，模型组大鼠逐渐出现对外界刺激反应迟钝，行动缓慢，毛色枯黄，无光泽，眼结膜苍白，体质量增加缓慢。假手术组大鼠行动、反应、毛色无异常。观察至4周、8周时模型组各死亡1只。

2.2 大鼠肾功能及炎性因子变化

模型组大鼠血肌酐、尿素氮、TNF-α、IL-6、LPS水平较假手术组升高(P<0.05)，并且这些指标在8周时较4周时升高(P<0.05)(表1)。

2.3 大鼠肾脏、结肠组织病理变化

模型组肾脏逐渐出现肾小管扩张，间质炎性细胞浸润，间质纤维化，8周时模型组肾脏组织可见肾小球硬化，间质纤维化加重(图1)。模型组肠绒毛萎缩、倒塌，黏膜层炎性细胞浸润，并且在8周时组织损伤加重(图2)。

2.4 大鼠结肠上皮细胞紧密连接蛋白、自噬相关蛋白表达变化

CRF模型组大鼠结肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1和自噬蛋白beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达较假手术组下降，并且随着时间推移，在8周时表达较4周下降更多(P<0.05)(图3～4)。

表1 各组血肌酐、尿素氮、TNF-α、IL-6和LPS水平Table 1 The level of creatinine, urea nitrogen, TNF-α, IL-6 and

图1 各组大鼠肾脏组织病理HE染色Fig 1 HE staining of rat kidney(×100)

图2 各组大鼠结肠组织病理HE染色Fig 2 HE staining of rat colon(×200)

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with CRF 4 weeks group图3 各组结肠组织肠上皮细胞紧密连接蛋白表达Fig 3 Expression of tight junction protein in colon

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with CRF 4 weeks group图4 各组结肠组织肠上皮细胞自噬相关蛋白表达Fig 4 Expression of autophagy related protein in colon

3 讨论

CRF可导致全身多个系统器官的损伤，其中消化系统最常见，表现为恶心、呕吐、腹泻或便秘等症状。结肠是产生尿毒症毒素的重要器官，近年的研究显示，CRF时尿毒症毒素的蓄积可引起肠黏膜屏障的损伤，而肠黏膜屏障损伤会导致全身炎性反应状态，进而加重肾脏损伤，甚至引起全身并发症[5]，形成恶性循环。

肠黏膜屏障主要包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障及化学屏障等。研究表明[6]，CRF患者体内LPS和D-乳酸水平升高，提示肠道细菌代谢产物经受损的肠道屏障进入血液循环。随后的研究则发现[7]，CRF大鼠肠道组织表现出黏膜损伤，通透性增加，上皮细胞间紧密连接蛋白表达下降。同时尿毒症引起肠道菌群的结构发生改变，主要表现为益生菌的减少和致病菌的大量繁殖等[8]，进而导致全身微炎性反应状态。

本研究采用左肾切除联合腺嘌呤灌胃的方法成功制作CRF的大鼠模型，模型组血肌酐、尿素氮、炎性因子及LPS水平较对照组升高，并且随着观察时间延长，肾小球硬化和间质纤维化的病理损害加重。跨膜紧密连接蛋白claudin家族和ZO蛋白是组成细胞间紧密连接的重要成分，本研究发现，模型组结肠组织出现肠绒毛萎缩、倒塌、炎细胞浸润，claudin-1和ZO-1的表达下降，提示CRF时存在肠黏膜屏障损伤，与报道[9-10]的研究结果相似。

自噬在维持肠黏膜屏障正常功能中具有重要作用。近年来的研究发现，肠上皮细胞自噬是肠道防御细菌入侵和调节黏膜炎性反应的重要机制[11]。雷帕霉素诱导自噬可改善IL-10敲除小鼠结肠连接蛋白的表达下降，降低促炎细胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-17)、趋化因子(CXCL-1和CXCL-2)表达及结肠的通透性，改善肠道屏障功能[12]。抗生素引起的肠上皮紧密连接屏障功能障碍与小鼠肠道微生物群失调、NLRP3炎性小体激活和自噬有关[13]。Beclin-1在自噬小体形成的早期，与Ⅲ型磷酸肌醇3 激酶(PI3KC3) 形成复合体，调节其他自噬相关基因表达蛋白在自噬前体中的结构定位，从而促进自噬体的形成[14]。LC3 是自噬的标志物，当自噬被激活，胞质中的 LC3-Ⅰ通过与脂质分子磷脂酰乙醇胺结合转化为 LC3-Ⅱ，介导自噬溶酶体的形成[15]。本研究发现，CRF大鼠结肠组织中存在大量炎性细胞的浸润，体内炎性因子水平升高，LC3Ⅱ/Ⅰ、beclin-1表达下降，提示CRF时机体存在炎性反应状态，结肠上皮细胞存在自噬异常。

综上，肠黏膜屏障损伤参与CRF的进展过程，自噬障碍可能是CRF肠黏膜屏障损伤的重要机制和值得探索的治疗靶点。