Box-Behnken响应面法优化橘红提取液的制备工艺

蔡里帆, 李小池

（1.广州市司法局戒毒医院, 广东广州 510435；2.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）, 广东广州 510095）

化橘红为岭南道地药材, 具有清热化痰、消炎止咳、解毒活血等功效, 常用于痰咳、风热感冒或相关上呼吸道炎症的治疗, 可单用或配伍组方。研究表明, 化橘红对体内多种炎症相关生理因子, 如IL-2、IL-6、TNF-α, 或PPAR系列受体有较好的抑制、调控作用, 应用较为广泛[1-4]。同时, 化橘红也可制备成提取物便于使用和调剂；为提升化橘红提取液中所含成分对疾病治疗的针对性, 提高药效, 有必要对其制备工艺进行优选。

Box-Behnken响应面法是目前应用较为广泛的实验设计和参数筛选方法, 相较单因素设计等传统方法, 该方法效率较高, 考察较为全面, 具有较好的先进性[5]。此外, 文献报道显示, 化橘红中富含柚皮苷, 该成分具有较强的抗炎、止咳、增强免疫作用, 可以作为本文工艺研究的结果指标[6-8]。

1 仪器和实验材料

含量测定使用Waters 2695型高效液相色谱仪, 配备PDA检测器, 自动进样器和柱温箱, 由美国Waters公司生产；样品称取使用Mettler-Toledo自动分析天平, 由瑞士Mettler-Toledo公司生产；回流提取使用数显控温电热套, 由河南爱伯特科技发展有限公司生产；制备化橘红提取液用乙醇为分析纯, 由广州化学试剂厂生产；样品测定用乙腈、甲酸为色谱纯, 由德国Merck公司生产；实验用水为超纯水, 由杭州娃哈哈公司生产；柚皮苷对照品（批号：110722-201815）购自中国食品药品检定研究院；实验用化橘红药材饮片购自广州中芝园药业有限公司。

2 方法和结果

2.1 实验设计 选择提取时间、乙醇含量、提取次数为考察参数, 范围分别为15～90min, 20%～100%, 1～3次, 输入Design Expert软件中, 由系统自动给出各实验组参数, 根据实际情况和仪器性能进行调整后, 得表1所述工艺参数。根据上述参数制备化橘红提取液（取样量为2g/份, 溶剂用量为25ml）, 所得溶液滤过后, 适当浓缩, 置于25ml量瓶中, 加乙醇定容至刻度, 所得溶液待测。

表1 Box-Behnken参数设计和实测结果

2.2 对照品的制备 取柚皮苷对照品, 精密称取约5mg, 置于5ml量瓶中, 加乙醇溶解并定容至刻度, 得浓度为1mg/ml的对照品溶液, 备用。

2.3 供试品的制备 取“2.1”项下制备的化橘红提取液, 精密吸取1ml, 置于10ml量瓶中, 加乙醇稀释至刻度, 摇匀, 滤过, 取续滤液为供试品溶液。

2.4 样品测定方法 使用Waters XBridge C18色谱柱（规格250mm*4.6mm, 填料粒径5μm）, 流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）, 梯度洗脱, 程 序 为, 0～15min, 20%～20%A；15～20min, 20%～90%A；20～25min,90%～20%A；流 速1.0ml/min, 检测波长283nm, 柱温25℃；测定供试品和对照品所得色谱、光谱图见图1、图2。

图1 柚皮苷对照品（浓度50μg/ml）和供试品色谱图

图2 柚皮苷对照品（浓度50μg/ml）和供试品光谱图

2.5 含量测定方法学考察

2.5.1 线性和范围 取柚皮苷对照品溶液, 加甲醇逐级稀释, 配制成浓度分别为200、100、50、20、10、5μg/ml的溶液, 所得溶液注入HPLC中, 按“2.4”项下方法测定, 记录各样品中柚皮苷的峰面积, 代入excel软件中计算回归方程和相关系数, 得方程为y=20559x-47302（r2=0.9993, x为浓度, y为峰面积）；上述结果表明, 方法线性良好, 能够对浓度为5～200μg/ml的柚皮苷进行准确测定。

2.5.2 精密度考察 取供试品溶液, 连续使用“2.4”项下方法测定6次, 记录各样品中柚皮苷的峰面积, 计算峰面积的RSD, 结果显示, RSD为0.90%, 表明方法精密度良好。

2.5.3 稳定性考察 将供试品溶液放置在自动进样器中, 分别于0、2、4、6、8、12h使用“2.4”项下方法测定, 记录各样品中柚皮苷的峰面积, 计算含量和含量的RSD, 结果显示, RSD为0.82%, 表明方法所制备样品稳定性良好。

2.5.4重复性考察 取化橘红提取液, 按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液, 再使用“2.4”项下方法测定, 记录各样品中柚皮苷的峰面积, 计算含量和含量的RSD, 结果显示, RSD为0.56%, 表明方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率测定 取化橘红提取液, 精密吸取0.5ml, 转移至10ml量瓶中, 按表2所示加入不同量的柚皮苷对照品溶液, 混匀后加乙醇定容至刻度, 滤过, 取续滤液按“2.4”项下方法测定, 记录各样品中柚皮苷的峰面积, 计算含量、回收率和回收率的RSD, 结果显示, 柚皮苷平均回收率为99.21%, RSD2.30%, 表明方法准确度良好。

表2 加样回收测定结果（n=3）

2.6 样品测定 取根据“2.1”项下设计参数制备的化橘红提取液, 按“2.3”项下方法制备供试品溶液, 再使用“2.4”项下方法测定, 记录各样品中柚皮苷的峰面积, 计算含量。所得结果导入Design Expert软件中, 得出响应面图, 见图3。根据结果可知, 当提取时间为50min, 乙醇含量60%, 提取次数2次时, 所制备样品为最优, 提取液中化橘红含量为0.2684-0.2710mg/ml。

图3 Box-Behnken响应面法优化结果（n=3）

3 讨论

由表1可知, 提取时间、含醇量、提取次数三个参数中, 乙醇含量对柚皮苷的提取效率影响最大, 但当乙醇含量为100%时, 柚皮苷含量并非最高点（最高点为75%）, 同时, 最高点与60%乙醇相比, 柚皮苷含量提升并不明显, 表明乙醇含量对提取效率的提升并非线性, 应当根据曲线走势, 结合提取效率、能耗、溶剂、环境保护等因素谨慎选择, 而非以最高点为最优。提取时间对柚皮苷含量影响仅次于含醇量, 随提取时间增加, 柚皮苷含量也随之增加, 但当提取时间超过70分钟后, 柚皮苷产量提升不明显, 表明该时间已经能够较为充分提取柚皮苷, 继续增加提取时间并无实际意义。提取次数的影响与提取时间类似, 当该数值从1次增加至两次时, 柚皮苷含量明显升高, 表明一次提取并不充分；但当提取次数升至3次后, 所得溶液中柚皮苷含量并无明显提升。综合上述分析, 可知系统所建议的提取参数确为最优参数, 表明本文所用实验设计方法高效、全面、准确。