突变T.fusca角质酶对涤纶织物表面水解作用研究

韩瑞娟, 傅佳佳, 王艳萍, 孟超然, Artur Cavaco-paulo, 王鸿博, 高卫东

(1.江南大学 纺织科学与工程学院,江苏 无锡 214122; 2.米尼奥大学 生物工程中心,葡萄牙 布拉加 4710-057)

涤纶作为被广泛使用的合成纤维之一,具有许多优良的特性,如弹性模量高、强度高、良好的保形性等[1]。涤纶结构致密且大分子链中缺乏反应性基团,导致其染色易出现色淀,织物吸湿性差,穿着闷热,影响了涤纶织物的美观性和服用舒适性[2]。为了解决上述问题,许多学者进行了大量的研究工作。目前,涤纶织物的亲水改性可以在各个工序中进行。如在纺丝过程中可以采用复合材料或者多孔化等方法,而表面处理过程中可以通过接枝、亲水性整理剂、酶改性等。前者对设备和工艺要求较高,成本费用高,后者相对简单,操作方便,是目前主流的改性方法[3]。

在众多的表面处理方法中,生物酶反应条件温和、对环境友好,通过水解涤纶的酯键可改善织物的疏水性[4]。酶法处理与传统碱减量改性法相比,减少了织物的质量损失,保留了织物的强度[5];与等离子体改性法相比,所需能耗更低和生成的表面基团稳定性更好,满足当前碳中和、碳达峰目标的要求。因此,利用生物酶改善涤纶织物的润湿性具有较好的发展前景[6]。

近年来,诸多研究报道了使用酶改性涤纶织物,主要包括脂肪酶、角质酶、PETase等。脂肪酶具有的“盖子”结构覆盖了酶的活性位点,需要油水界面活化帮助底物与催化中心的结合,改性效果较差[7]。PETase是Yoshida从Ideonella sakaiensis 201-F6中分离出的一种特殊水解酶,目前对PETase的研究都集中在提高稳定性、活性及降解聚酯类塑料的机制上面,用于水解高结晶度的涤纶织物仍然缺乏深入研究[8]。角质酶的催化中心暴露于溶剂之中,不存在“盖子”结构,有助于酶识别聚合物底物。相较于脂肪酶,角质酶及其同系物对涤纶表现出更好的应用前景[9]。但与化学改性相比,使用角质酶改性涤纶织物仍然存在着改性时间长、水解产物少、改性效果差的缺点,如Nimchua[10]报道的茄病镰刀菌DSM 62420在168 h内催化涤纶水解仅可得到10 μg/mL的水解产物,而尖孢镰刀菌也只得到18 μg/mL的对苯二甲酸。由此可见,缩短反应时间、提升改性效果是当前新的研究方向。

本研究将热稳定性能优异的突变Thermobifidafusca(T.fusca)角质酶应用于涤纶织物改性,探究了反应条件(酶质量浓度、处理时间、温度、pH值)、表面活性剂和金属离子等对涤纶水解产率的影响,并表征改性前后涤纶织物的表面形貌与润湿性能。

1 试 验

1.1 材 料

纯涤纶织物(吴江市中鹏纺织有限公司),突变T.fusca角质酶(江南大学食品科学与技术国家重点实验室),对硝基苯丁酸酯(西格玛奥德里奇贸易有限公司),对苯二甲酸、无水乙醇、氯化钙、十二烷基硫酸钠、亚甲基蓝、碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 角质酶活性测量

酶活测定采用连续分光光度法[10]。反应液的总体积是1.5 mL,其中包括30 μL的突变T.fusca角质酶和1 440 μL的pH 8的Tris-HCl缓冲液及30 μL的对硝基苯丁酸酯底物,将反应液于60 ℃下反应1 min后,在波长405 nm处记录对硝基酚的生成速率。酶活定义:每分钟催化对硝基苯丁酸酯水解生成1 μmol对硝基苯酚的酶量,即为一个酶活力单位。

1.2.2 涤纶织物精炼处理与角质酶处理

将涤纶织物置于5 g/L肥皂、4 g/L的碳酸钠溶液中进行皂洗30 min以去除浆料和杂质,然后用去离子水反复冲洗,在105 ℃的烘箱中烘干备用。

将精炼后的织物按照1︰40的浴比放入缓冲液中,探究酶质量浓度(10～30 U/g),pH值(7～9)、温度(50～70 ℃)、反应时间(12～72 h)和CaCl2(0～20 mmol/L)等因素对涤纶织物酶处理液中水解产物释放量的影响。酶处理后的织物先后用1%十二烷基硫酸钠和20%乙醇清洗,然后放入烘箱中烘干以备后续测试。

1.3 测 试

1.3.1 对苯二甲酸标准曲线的绘制

采用紫外分光光度法测定突变T.fusca角质酶处理残液中产物对苯二甲酸(TPA)的释放量,参照文献[11]绘制对苯二甲酸标准曲线,如图1所示。得出对苯二甲酸标准曲线方程:

A=7.14 286×10-4+5.69×10-3×C(R2=0.999 5)

(1)

式中:A为240 nm处的紫外吸光度值,C为TPA质量浓度。

图1 TPA的标准曲线Fig.1 Standard curve for TPA

1.3.2 酶处理残液吸光度测试

将突变T.fusca酶反应液置于100 ℃的水浴锅中保温30 min使酶失活,并在离心机中以8 000 r/min的速度离心10 min后取上清液进行紫外测试。在其他反应条件一样的情况下,以不加织物的酶处理液为参比,在240 nm波长下测定样品处理液的吸光度。

1.3.3 涤纶水解产物种类分析

用安捷伦1200系列的高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)在240 nm波长下检测涤纶织物的水解产物种类,其中流动相甲醇︰水=65︰35,流速0.5 mL/min,进样量5 μL。

1.3.4 涤纶织物表面形貌观察

为了进一步分析涤纶纤维经酶处理后表面形态的变化,本研究利用SU1510扫描电子显微镜(日本日立公司)在放大倍数分别为3 000、10 000倍时进行观察,其中电压设置为5 kV。

1.3.5 接触角测试

在恒温恒湿条件下,利用DSA 25接触角测量仪(德国KRUSS公司)对处理前后试样的水接触角进行测量,当水滴滴下5 s后,对接触角数值进行记录。其中液滴体积为10 μL,滴液速度为1 mL/min。

1.3.6 回潮率测试

织物吸湿性能用回潮率表示,按GB/T 6529—2008《纺织调湿和试验用标准大气》,在温度(20±1) ℃、湿度(65±2)%的试验环境测试。

(2)

1.3.7 涤纶织物表面基团变化分析测试

角质酶水解涤纶分子链上的酯键可产生羟基等亲水性基团,从而吸附阳离子型的亚甲基蓝染料。因此,通过检测涤纶织物的染色深度,可以表征织物表明活性基团的变化[12]。同时,亚甲基蓝染料在660 nm左右波长下有特征吸收峰,可测试染色前后样品的吸光度[8]。同时,为了探究改性织物对分散染料上染率的影响,用分散蓝165染料对改性前后的织物进行染色,特征吸收峰在665 nm左右。染色工艺条件:染料质量浓度1 g/L,浴比1︰50,染色时间2 h,染色温度60 ℃。染色后的涤纶织物用去离子水反复冲洗后,放在室温下干燥48 h后,使用测配色仪测量K/S值。

2 结果与分析

2.1 突变T.fusca角质酶质量浓度对水解产物释放量的影响

酶质量浓度是影响涤纶织物改性效果的重要因素,合适的酶质量浓度既可以保证其对底物的催化活化能力,又不会造成资源的浪费。探究角质酶质量浓度对水解产物释放量的影响,可以得到反应体系较合适的酶浓度。由图2(a)可知,在温度60 ℃、pH 8、时间48 h的条件下,随着突变T.fusca角质酶质量浓度的增加,涤纶织物的水解产物释放量增加。当角质酶质量浓度在20 U/g时,水解产物TPA的含量达到最大值。继续增大酶质量浓度,水解产物的量反而下降,一方面可能是涤纶纤维表面没有足够多的作用位点与角质酶的活性位点结合导致催化水解效果降低[13]。另一方面也可能是中间水解产物对苯二甲酸单2羟乙酯(MHET)具有竞争性抑制作用而导致酶解作用降低[5]。

2.2 反应时间对水解产物释放量的影响

角质酶具有一定的活性周期,催化能力会随着时间的变化而变化,因此需要根据水解产物释放量得出合适的催化反应时间。由图2(b)可知,在角质酶质量浓度20 U/g、反应温度60 ℃、pH 8的条件下,随着处理时间的延长,涤纶织物的水解产物含量逐渐增加。处理时间在12～48 h,水解产物释放量增加显著,但当处理时间超过48 h后,产物的增加量趋于平缓。这是因为在48 h之前,突变T.fusca角质酶可快速催化水解涤纶表面的酯键。但超过48 h后,涤纶表面可被水解的酯键数量变少,而大分子的蛋白酶很难渗入到结构致密的涤纶分子内部,使得酶与涤纶的可及性降低,水解速率下降[13]。

2.3 处理温度对水解产物释放量的影响

酶的稳定性会受到温度的影响,因此,合适的酶反应温度是保证酶活性和最大催化效率的重要因素。由图2(c)可知,在角质酶质量浓度20 U/g、时间48 h、pH 8的反应条件下,随着处理温度的升高,水解产物释放量先增加后降低,在处理温度为60 ℃时水解产物释放量最高。这主要是因为温度比较低时,角质酶的活性没有被全部激发,但当温度过高时,酶的结构发生不可逆变化,导致其变性甚至失活,使水解产物的释放量下降[13]。

2.4 pH值对水解产物释放量的影响

pH值决定酶蛋白分子的电离状态,从而影响酶的活性和与底物的结合频率,因此,合适的pH值会使得反应速率增加。由图2(d)可知,在角质酶质量浓度20 U/g、时间48 h、温度60 ℃的反应条件下,反应液的pH值为8时,水解产物释放量最大;但当pH值偏离8后,水解产物释放量有所下降。这是因为当pH值过高或过低时,突变T.fusca角质酶的分子活性部位有关基团的解离状态发生改变,酶的活性下降,其和底物之间的结合力降低,不利于酶解反应的进行[14]。

图2 反应条件对产物TPA释放量(质量浓度)的影响Fig.2 Influence of reaction conditions on TPA yield (mass-volume concentration)

2.5 金属离子对水解产物释放量的影响

合适的金属离子在提高水解酶的热稳定性和催化行为中起着至关重要的作用[15]。基于Then等[16]的试验,考察了不同浓度的Ca2+存在下对突变T.fusca角质酶水解涤纶产物的影响。由图3可以看出,当Ca2+体积浓度从0增大至15 mmol/L时,水解产物TPA释放量从15 mg/L增加到25 mg/L,较单独酶处理提高了53%,比Nimchua等[10]报道的尖孢镰刀菌催化涤纶水解的产物浓度高28%。金属离子的存在使TPA释放量有较大提升,这是因为金属离子与酶的配体进行了结合,酶活性中心的微环境得到改善,酶的空间结构发生改变,酶热稳定性能增加[16-17]。

图3 Ca2+体积浓度对TPA释放量的影响Fig.3 Effect of Ca2+ volume concentration on TPA yield

2.6 水解产物种类测定

为揭示酶的水解作用机制,需进一步对水解产物做鉴定分析。本研究将Ca2+和角质酶体系催化涤纶水解反应残液进行了高效液相色谱测定,结果如图4所示。Puspitasari等[18]研究表明,聚酯的酯键水解会产生TPA、MHET、对苯二甲酸双(2羟乙)酯(BHET)等多种产物,但Yoshida等[19]表明PETase水解酶会进一步将水解产物BHET分解成MHET和TG。由图4可以看出,该突变T.fusca角质酶的主要水解产物是TPA,而中间水解产物MHET含量较少,BHET没有被检测到,推测是由于金属离子的引入使得酶热稳定性能增加,从而将BHET进一步被水解成MHET。除此之外,将突变T.fusca角质酶与PETase等活性较高、降解聚酯塑料较优异的酶复配用于涤纶改性上,以避免中间水解产物的竞争性抑制也是一个值得探索的方向。

图4 酶水解涤纶反应液的液相色谱示意Fig.4 HPLC chart of enzymatic hydrolysis polyester reaction solution

2.7 涤纶织物表面形貌分析

酶处理前后涤纶织物的表面形貌如图5所示。由图5可见,未处理的织物表面比较光滑;而经过酶处理后,涤纶织物表面呈现出不同程度的凹槽。这可归因于酶对涤纶的无定形区进行了水解,使得纤维表面变得粗糙,同时也可以看出酶对涤纶的水解仅限于表面一层,可保留涤纶本身的性能。

图5 酶处理前后涤纶织物SEM图Fig.5 SEM images of polyester fabric before and after enzyme treatment

2.8 涤纶织物表面润湿性能分析

涤纶织物经过酶处理后,润湿性能有所改善,改善效果可由接触角、回潮率、K/S值等表征。图6为角质酶处理前后涤纶织物的水接触角与回潮率的变化。由图6可见,织物经Ca2+与角质酶体系处理后接触角由92.6°减小到76.4°,降低了17.5%;回潮率由0.64%增大到1.19%,增大了85.93%。主要原因为角质酶对大分子链中的酯基进行水解,从而产生了亲水性活性基团。此外,由于角质酶处理导致分子链断裂,使纤维表面有裂隙现象,这可在扫描电镜图5中得到证实。图7表示角质酶处理前后涤纶织物的K/S值和染液吸光度值的变化。由图7(a)可见,经过角质酶处理后,由亚甲基蓝染色的涤纶织物K/S值增大,染液的吸光度值减小,说明涤纶织物的大分子链水解,产生了亲水性基团,使得染色深度增加。与原布相比,Ca2+与酶体系处理后的织物K/S值增加了17.9%,663 nm处的吸光度值减小了43%。由图7(b)可知,改性前后的涤纶织物经过分散蓝165染料染色后,染色深度有所增加,但增加并不明显。这是因为分散蓝165染料只能进入涤纶大分子非结晶区,而酶蛋白的催化水解作用是在纤维表面,对涤纶纤维结晶度影响不大,因此织物的染色深度没有显著变化[20-21]。

图6 酶处理前后织物接触角和回潮率变化Fig.6 Changes in contact angle and moisture regain of fabricsbefore and after enzyme treatment

图7 酶处理前后染液吸光度值与K/S值变化Fig.7 Changes of absorbance and K/S value of dye solution before and after enzyme treatment(注:柱状图为K/S值变化,折线图为染液吸光度变化)

3 结 论

本研究采用突变T.fusca角质酶对涤纶进行表面改性处理,由水解产物释放量确定最佳反应条件。同时发现金属离子可强化酶对涤纶的水解,使得水解产物释放量提升。改性后的织物表面有凹槽、裂隙现象,润湿性能和染色性能得到改善。

1) 单因素变量分析确定突变T.fusca角质酶水解涤纶织物适宜的反应条件为:角质酶质量浓度20 U/g、温度60 ℃、反应时间48 h、pH值为8。

2) 15 mmol/L的Ca2+的加入可使水解产物释放量较单独用酶处理提高53%,可强化酶对涤纶的水解作用。

3) 经鉴定,水解产物主要是TPA,MHET占比较少,BHET没有被检测到。角质酶处理后的纤维有明显的刻蚀现象。同时,与未经过酶改性处理的织物相比,酶改性织物的K/S值提升,亚甲基蓝的染液吸光度下降43%,接触角降低17.5%,回潮率增大85.93%,表明角质酶使得涤纶酯键断裂,纤维表面产生亲水性基团,润湿性能得到改善。

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