马钱苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤神经保护作用及Wnt/β-catenin通路的影响

王璐 付蓉 巫玉娟

(贵阳市第二人民医院神经内科，贵州 贵阳 550018)

脑卒中是全球死亡和残疾的主要原因之一，对于缺血性脑卒中患者，在发病后3.0～4.5 h内给予组织纤溶酶原激活剂治疗是最有效的方法之一，然而，恢复缺血大脑的血流可能会导致缺血再灌注(I/R)损伤，对缺血大脑造成更严重的伤害〔1〕。因此，迫切需要进行探索性研究，以发现改善或预防脑I/R损伤的药物，尼莫地平是目前常用药物。中药历史悠久，已广泛用于亚洲许多国家和地区，如补阳还五汤和脑栓通等在实验动物模型中显示出有益反应，可减轻I/R损伤〔2〕。马钱苷是从山茱萸中提取的主要有效成分，具有较强的抗炎和抗氧化能力。研究显示，山茱萸提取物对缺血性脑损伤大鼠具有神经保护作用，但马钱苷对I/R损伤的作用研究较少〔3〕。研究发现，脑卒中后神经系统功能的重建涉及许多蛋白质和信号通路，其中Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路参与脑缺血后的神经发生和功能恢复，阻断Wnt信号通路可抑制大鼠神经祖细胞(NPC)的增殖和分化〔4〕。β-catenin是Wnt信号通路的关键下游介质，它激活涉及中枢神经系统神经元存活和体内稳态的多个靶基因〔5〕。研究表明，刺激Wnt/β-catenin通路可诱导缺血损伤后神经元分化和存活的神经源性环境〔6〕。此外，激活肝脏Wnt/β-catenin通路可通过改善氧化应激和抑制促炎性细胞因子的释放来减轻I/R损伤〔7〕。因此，Wnt/β-catenin通路是I/R治疗的一个很好的潜在靶点。本研究探讨马钱苷对大鼠局灶性I/R的神经保护作用，同时探讨Wnt/β-catenin通路在该过程中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级成年SD雄性大鼠购自重庆医科大学实验动物中心，8～10周龄，体重(230±20)g，动物生产许可证号：SCXK(渝)2019-0003，动物使用许可证号：SYXK(渝)2019-0016，动物质量合格证号：HR2019001746，在环境温度(23±2)℃，相对湿度60%～70%，光照12 h明暗交替的环境中饲养，适应性喂养1 w后进行实验。

1.2主要试剂与仪器 马钱苷(原料药，纯度99%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：M-010-160516)；尼莫地平片(上海世康特制药有限公司，规格30mg，批号：20191225)；戊巴比妥钠(上海上药新亚药业有限公司，批号：SC-6017)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(中生北控生物科技有限公司，批号：QM30217S)；大鼠丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(上海生工生物工程有限公司，批号：SK039、YT297)；Trizol试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒和SYBR® Premix Ex TaqTM荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒(大连宝生物工程有限公司，批号：DRR152A、DRR047A、DRR041A)；HBS-1096B型酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)；CFX96型实时荧光定量PCR仪(美国BD公司)。

1.3造模、分组及给药 采用线栓法制备大鼠脑I/R模型：大鼠禁食12 h后用3%戊巴比妥钠(300 mg/kg)进行麻醉后分离劲总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉远端后，在颈外动脉上切开一个小切口，将一条丝线插入颈内动脉约20 mm，并结扎，2 h后拔出丝线，以重新供应血流制备再灌注模型〔8〕。将造模成功的48只大鼠按随机数表法分为模型组、马钱苷低剂量组、马钱苷高剂量组和尼莫地平组，每组12只；另取12只大鼠作为假手术组，假手术组只分离血管不进行阻塞血流。造模成功2 h后，假手术组和模型组灌胃生理盐水(10 ml/kg)；马钱苷低剂量组和马钱苷高剂量组分别灌胃50 mg/kg和100 mg/kg马钱苷〔9〕(将马钱苷和生理盐水配制成浓度分别为5 mg/ml和10 mg/ml的溶液，灌胃体积10 ml/kg)；尼莫地平组灌胃20 mg/kg尼莫地平〔10〕(将尼莫地平和生理盐水配制成浓度为2 mg/ml的溶液，灌胃体积10 ml/kg)，1次/d，连续给药7 d。

1.4神经运动功能评分〔11〕末次给药后1 h对大鼠的神经运动功能进行评估：5分：完全无法走路；4分：无法自发行走和失去知觉；3分：走路时向内倾斜；2分：走路时向内旋转；1分：前爪无法完全伸展；0分：无神经功能障碍症状。

1.5脑梗死体积百分比测定 采用脊髓脱臼法处死大鼠，取完整脑组织，将大鼠脑组织行冠状位切片(2 mm)，2%的TTC染液染色30 min，用Image Pro Plus6.0软件测定脑梗死体积，计算脑梗死体积百分比，脑梗死体积百分比=脑梗死体积/完整脑组织体积×100%。

1.6ELISA检测脑组织中MDA和GSH水平 取一块脑组织，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，用研钵将脑组织研碎，离心取上清，根据试剂盒说明书进行MDA和GSH水平测定。

1.7实时荧光定量-PCR(qRT-PCR)检测脑组织中Wnt、β-catenin、神经元生成素(Ngn)2、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X 蛋白(Bax)mRNA水平测定 制成脑组织匀浆，加入Trizol试剂进行总RNA的提取，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。Wnt、β-catenin、Ngn2、Bcl-2、Bax和GAPDH引物由大连TaKaRa公司设计并合成，引物序列，Wnt正向引物:5′-TTCTGAGGAAGAACAGCATGAA-3′,反向:5′-CCTTTTGGAGTCTGACCATTTC-3′；β-catenin正向引物:5′-CTGCTAACTGACCAAAATGACG-3′,反向:5′-AACAGTGGGTAGGTATGATGGC-3′；Ngn2正向引物:5′-AGCGTCAACAGGGAGATG-3′,反向:5′-CTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′；Bcl-2正向引物:5′-GGGAGGATTGTGGCCTTCTT-3′,反向:5′-TGTGCAGGTGCCGGTTCAG-3′；Bax正向引物:5′-ATCATGGGCTGGACATTGGA-3′,反向:5′-ACAGGGACATCAGTCGCTTCA-3′；GAPDH正向引物:5′-GCCAAGGCTGTGGGCAAGGT-3′,反向:5′-TCTCCAGGCGGCACGCAGA-3′。制备25 μl反应体系，包括：SYBR® Premix Ex Taq 12.5 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、cDNA模板2 μl、焦碳酸二乙酯(DEPC)水8.5 μl。在95℃预变性1 min，95℃变性30 s，58℃退火5 s，共30个循环，72℃延伸5 s条件下进行扩增，以GAPDH作为内参，采用 2-△△Ct法计算Wnt、β-catenin、Ngn2、Bcl-2、Bax mRNA的相对表达量。

1.8统计学分析 采用SPSS24.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组神经运动功能评分和脑梗死体积百分比比较 与假手术组相比，其余各组神经运动功能评分和脑梗死体积百分比均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，马钱苷各剂量组和尼莫地平组神经运动功能评分和脑梗死体积百分比显著降低(P<0.05)，且马钱苷高剂量组神经运动功能评分和脑梗死体积百分比显著低于马钱苷低剂量组(P<0.05)；但马钱苷各剂量组作用效果显著差于尼莫地平组(P<0.05)。见表1。

表1 各组神经运动功能评分和脑梗死体积百分比比较

2.2各组脑组织中MDA和GSH水平比较 与假手术组相比，其余各组脑组织中MDA水显著升高，GSH水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，马钱苷各剂量组和尼莫地平组脑组织中MDA水平显著降低，GSH水平显著升高(P<0.05)，且马钱苷高剂量组脑组织中MDA水平显著低于马钱苷低剂量组，GSH水平显著高于马钱苷低剂量组(P<0.05)；但马钱苷各剂量组作用效果显著差于尼莫地平组(P<0.05)。见表2。

表2 各组脑组织中MDA和GSH水平比较

2.3各组脑组织中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平比较 与假手术组相比，其余各组脑组织中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，马钱苷各剂量组和尼莫地平组脑组织中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平显著升高(P<0.05)，且马钱苷高剂量组脑组织中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平显著高于马钱苷低剂量组(P<0.05)；但马钱苷各剂量组作用效果显著差于尼莫地平组(P<0.05)。见表3。

表3 各组脑组织中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA水平比较

2.4各组脑组织中Bcl-2、Bax mRNA及Bcl-2/Bax水平比较 与假手术组相比，其余各组脑组织中Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax水平显著降低，Bax mRNA水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，马钱苷各剂量组和尼莫地平组脑组织中Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax水平显著升高，Bax mRNA水平显著降低(P<0.05)，且马钱苷高剂量组脑组织中Bcl-2 mRNA和Bcl-2/Bax水平显著高于马钱苷低剂量组，Bax mRNA水平显著低于马钱苷低剂量组(P<0.05)；但马钱苷各剂量组的作用效果显著差于尼莫地平组(P<0.05)。见表4。

表4 各组脑组织中Bcl-2、Bax mRNA及Bcl-2/Bax水平比较

3 讨 论

山茱萸是一种传统的中药制剂，其提取物已广泛用于脑血管疾病研究。马钱苷是山茱萸的主要活性成分，已有研究证实，马钱苷通过抗炎和抗氧化作用对神经损伤具有保护作用〔12〕。因为抗氧化剂可以保护啮齿类动物脑缺血中的Wnt/β-catenin通路，保护NPC的丢失并恢复海马体在面对全脑辐射时受损的神经发生，所以马钱苷的神经保护和神经发生促进作用可能部分取决于它的抗氧化能力〔13〕。

Wnt/β-catenin通路在许多细胞事件的调节中很重要，包括预防细胞凋亡及促进细胞再生。在脑组织中，Wnt/β-catenin通路不仅有助于促进神经元存活，而且与神经胶质增殖有关〔14〕。研究表明，在I/R损伤后，Wnt/β-catenin激动剂氯化锂的给药对学习和记忆引起神经保护作用〔15〕。相反，缺血性脑卒中后，Wnt/β-catenin通路的拮抗剂Dickkopf(DKK)-1在缺血核心和半影区的神经元中被显著诱导，并加剧神经元的损害〔16〕。另外，通过小干扰RNA使β-catenin失活会增加成年大鼠脑卒中诱发的梗死体积〔17〕。因此，在脑缺血中激活Wnt/β-catenin通路可能是一个保护性靶点。Wnt蛋白广泛分布在整个大脑中，是细胞外因子，在发育和成熟的中枢神经系统中起关键作用。经典的Wnt信号通路是通过激活其跨膜受体卷曲蛋白(Frizzled)和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-5/6，导致散乱蛋白(Dvl)的激活。Dvl作为细胞质桥接分子，与β-catenin降解复合物(axin/GSK-3/APC)成员互激活，导致复合物解离，使β-catenin产生抗性，细胞质内的β-catenin稳定并进入细胞核，并与转录因子(尤其是T细胞因子和淋巴增强因子)结合，以调节靶基因的转录〔18〕。Ngn2已被证明是Wnt /β-Catenin信号传导中重要的神经发生促进因子，促进海马神经母细胞的分化〔19〕。本研究发现，马钱苷可增加局灶性I/R大鼠脑组织中Wnt、β-catenin、Ngn2 mRNA的表达，从而促进I/R后的神经发生。

易位到细胞核中的β-catenin，可以激活特定基因的表达，如Bcl-2和血管内皮生长因子(VEGF)，从而抑制细胞凋亡。β-catenin通过直接调控Bcl-2表达和以磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AkB)依赖的方式间接抑制Bax来抑制细胞凋亡〔20〕。由于Bcl-2/Bax活性对于细胞凋亡机制的激活/失活至关重要，因此这些蛋白很可能会参与I/R的发病机制〔21〕。Bcl-2通过阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质而具有抗凋亡作用，Bcl-2也中和Bax，防止它破坏线粒体膜。Bcl-2/Bax比值的增加或减少具有抗或促凋亡作用。缺血引起脑组织中Bcl-2水平降低和Bax表达增加，从而导致病变区域神经元丢失〔22〕。与上述研究一致，本研究结果表明马钱苷在缺血性脑卒中中具有抗凋亡的潜力。

综上，马钱苷可改善局灶性I/R大鼠神经功能缺损，其机制可能与马钱苷激活Wnt/β-catenin通路有关。